【骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的调节作用研究】 小鼠骨髓间充质干细胞

　　[摘要]目的：研究探讨小鼠骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的节作用影响情况。方法：通过流式细胞术研究对比衰老小鼠和年轻小鼠T细胞培养48h后CD8+CD28+的共表达率差异，根据以上研究结果分别对比隔离共培养组、混合共培养组和对照组之间T细胞上CD8+CD28+的共表达率差异。结果：实验一中衰老组培养48h后CD8+CD28+共表达率为（4.08±0.3493）%，年轻组培养48h后CD8+CD28+共表达率为（5.04±0.5741）%。两者相比有统计学差异（P 　　目前人们对骨髓间充质干细胞的生物学特性和作用的研究逐步深入。它不仅具有强大的自我更新能力，同时它还具有成骨、成软骨、成脂肪[7-8]、成肌[9]等向中胚层组织细胞分化的潜能，甚至具有向神经样细胞[10-11]等跨胚层分化能力。本实验拟在研究小鼠骨髓间充质干细胞对正常衰老小鼠的T细胞的调节作用，为下一步深入探讨骨髓间充质干细胞对衰老的调节作用奠定基础。
　　
　　1材料和方法
　　1.1实验动物：C57BL/6N小鼠12月龄15只，雌性，体重约30g。C57BL/6N小鼠6～8周龄5只，雌性，体重约20g。以上动物均为SPF级动物。
　　1.2仪器、试剂：CO2细胞培养孵箱（日本Hirasawa Works 公司）、Biofuge离心机（德国Heraeus公司）、Transwell培养皿（美国corning公司）、FACS Aria流式细胞仪（美国BD公司）、RPMI1640培养基（美国Hyclone公司）、DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）、特级胎牛血清（美国Gibco公司）、PE-anti-mouse CD8（美国biolegend公司）、FITC-anti-mouse CD28（美国biolegend公司）、小鼠淋巴分离液（中国医学科学院生物工程研究所）、200目细胞筛、10ml玻璃注射器。
　　1.3方法
　　1.3.1BM-MSCs细胞培养和传代：BM-MSCs购自于广州Cyagen公司，取自6～8周C57BL/6N雌性小鼠第六代细胞，先将BM-MSCs复苏，移入10cm培养皿中，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10ml，细胞融合70%～80%后传代，取出第九代细胞计数后，分成每106一份，10份备用。
　　1.3.2小鼠淋巴细胞悬浮液制备：麻醉小鼠，用碘汀消毒酒精脱碘后，断颈处死小鼠左下腹部剪开皮肤进入腹腔，分离出脾脏，PBS冲洗两遍，放到200目细胞筛上用10ml玻璃注射器内芯进行研磨，研磨后用RPMI1640培养基冲洗两边，放入5ml小鼠淋巴细胞分离液中，2 500rpm、20min慢加速慢减速离心，吸取第二层白色浑浊层，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml，1 500rpm、10min离心，移去上清，用15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml重新悬置，细胞计数后备用。
　　1.3.3分组和处理
　　1.3.3.1 实验一：①衰老组：五只12月龄的不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养；②年轻组：五只6～8周龄的不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。
　　1.3.3.2 实验二：①隔离共培养组：BM-MSCs与淋巴细胞以1:1比例放入Transwell系统，淋巴细胞取自不同的五只小鼠，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基共培养；②混合共培养组：BM-MSCs与淋巴细胞以1:1比例放入六孔板中，淋巴细胞取自不同的五只小鼠，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基共培养；③对照组：五只不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。
　　1.3.4检测：以上实验组和对照组在37℃、5% CO2细胞培养孵箱里培养48h后，吸出淋巴细胞，离心后加入100μl细胞染色缓冲液，隔离共培养组、混合共培养和对照组加入PE-anti-mouse CD8、FITC-anti-mouse CD28。4℃孵育40min，细胞染色缓冲液冲洗两遍，用流式细胞仪检测。
　　1.3.5 统计学方法：采用SPSS 13.0统计软件，所有数据用(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。P 　　综上所述，骨髓间充质干细胞可以使衰老T细胞变“年轻”。虽然机制还不清楚，但是在抗衰老方面必将拥有广泛的研究前景。
　　
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　　[收稿日期]2011-03-11 [修回日期]2011-04-26
　　编辑/张惠娟
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