G蛋白偶联受体的研究进展【ＶＥＧＦ及其受体与瘢痕疙瘩的研究进展】

　　瘢痕疙瘩(Keloid，K)又叫瘢痕瘤，发病机制不清，具有侵袭性生长和手术后容易复发的特点，是困扰整形外科医生的难题。研究表明，肿瘤血管期的启动是有瘤细胞产生的促内皮细胞增殖和迁移的血管生成因子所诱发，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在生理及病理血管再生中起关键性作用，本文探讨VEGF及其受体与瘢痕疙瘩的关系，阐明瘢痕疙瘩的生成机制，为预防和治疗瘢痕疙瘩提供一定的依据。
　　
　　1　VEQF的特点
　　
　　1．1　VEGF的概况：血管内皮生长因子又称血管通透因子(Vascular permeability factor，VPF)或血管调理素(vasculotropin)，是1989年Ferrara等在牛垂体滤泡星状细胞的体外培养液中首先纯化出来的糖类蛋白质。随后在鼠垂体前叶肿瘤细胞系AtT20、人单核细胞、豚鼠瘤、鼠神经胶质瘤细胞系等细胞培养液中也纯化出了VEGF蛋白。已证明VEGF是唯一对血管形成具有特异性的重要生长因子，其他生长因子如成纤维细胞生长因子、血小板衍生性生长因子等能作用于包括血管内皮细胞在内的多种细胞，但不具特异性。也有研究显示垂体细胞既是VEGF的来源又是其目标靶，这支持VEGF在脑下垂体的功能是作为自分泌／旁分泌因子的概念。VEGF是一类糖蛋白，广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、脾、肺、骨骼等组织中。多种细胞均可分泌，如Ec、EPC、骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)、成纤维细胞等。增殖性瘢痕中的VEGF主要由角质形成细胞、成纤维细胞产生。
　　
　　1．2　VEGF的家族、分类和结构特点：VEGF属于血小板衍生生长因子(platelet derived growthfactor，PDGF)家族，其结构与PDGF-β链部分相同，其中有8个相同半胱氨酸为PDGF家族的标志。
　　人类VEGF基因定位于染色体6P21.3，包括8个外显子和7个内含子，基因全长28kb，编码区域约为14kb。VEGF是一种外分泌的同源二聚体糖蛋白，由两条相同肽链通过二硫键构成二聚体，分子量为34～45ku，等电点为8.5，耐酸及耐热能力很强。互补脱氧核糖核酸(cDNA)克隆研究表明，VEGF存在五种不同形式的异构体，分别由121、165、145、189、206氨基酸组成。VEGF 121为可溶性糖蛋白，无结合肝素的特性，可自由扩散；VEGF 165具有肝素结合活性，只有50％以可溶性形式分泌到细胞外，余下的部分和细胞膜或基膜上含有肝素或硫酸乙酰肝素的蛋白多糖紧密结合；VEGF189、VEGF145和VEGF206分泌后几乎完全和含肝素的糖蛋白结合，测不出游离的部分。五种VEGF广泛分布于人和动物多种组织内，其生物活性没有发现显著差异，人体内的VEGF165是主要的分泌形式，也是主要的效应分子，对内皮细胞的体外增殖和血管生成作用最强。
　　VEGF除了有五个亚型外，还存在五种同源性蛋白，包括胎盘生长因子(Placental growthfactor，PGF)，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D和口疮病毒(orf vlrns VEGF，VEGF－E)。该五种同源性蛋白均在不同程度上具有促进血管生成的作用。
　　
　　2　VEGF受体及信号传导机制
　　
　　2．1　VEGF受体：VEGF通过旁分泌和自分泌形式产生后，必需与相应的受体结合才能产生促进血管生成的效应，既往研究认为VEGF的受体分为三个亚型，包括VEGFR－1、VEGFR－2和VEGFR－3，分别有flt－1、flk－1／KDR、flt－4基因编码。flt－1与VEGF结合引起内皮细胞的迁移和管样结构的维持，而KDR与VEGF结合主要刺激内皮细胞的增生，VEGFR－3则主要与淋巴内皮细胞增殖有关。近年来研究认为除了VEGFR－1、VEGFR－2及VEGFR－3，还存在neuropilin(NRP)，前者均由结合VEGF的细胞外成分和细胞内催化区部分组成，而NRP主要位于细胞内，NRP－1不仅通过促进VEGFR－2的活性和促进与VEGF的结合，还是VEGF特异性的受体亚型，可增加有丝分裂原和VEGF165的趋化活性，但对VEGF121作用不明显。
　　
　　2．2　信号传导机制：VEGF受体介导的信号传导与其他酪氨酸激酶受体非常相似。VEGF信号传导的第一步是活化受体，使其具有酪氨酸激酶活性。这是通过VEGF结合受体，引起受体分子在细胞膜上的二聚化，并使受体胞内激酶区特定的酪氨酸残基交叉磷酸化而实现的。活化的受体进而可激活一系列下游信号分子，如磷脂酶、蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶、丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等，并晟终传递至细胞核内，通过特定基因的表达实现VEGF的生物学效应。与其他酪氨酸激酶类受体一样，VEGF的胞内信号传导可能涉及多条途径。VEGF与受体结合后，细胞内最初表现ca浓度升高，1摩尔浓度的VEGF在几秒钟内可使Ca浓度升高4倍。这是目前检测VEGF活性最为敏感的方法。VEGF增加内皮细胞的Ca浓度通过其受体发生作用。
　　
　　3　VEGF在瘢痕疙瘩中的生物学效应
　　
　　3．1　促进内皮细胞的增殖：VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，具有能够刺激血管内皮细胞的分裂增殖和趋化作用。VEGF对内皮细胞的直接作用是VEGF与血管内皮细胞表面的受体结合，诱导受体自身和细胞内蛋白质的酪氨酸磷酸化，激活细胞上的磷酯酶c和水解磷酸肌醇，诱导钙离子的释放。它能诱导细胞表达纤维蛋白溶酶原激活因子、胶原酶和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活因子受体，在介导内皮细胞向组织迁移及组织修复中起重要作用。其中VEGF165与其他4种形式的VEGF相比，既有可溶性，又具有与受体特异性结合的位点，因此具有最强的有丝分裂活性。同时VEGF与bFGF有着协同作用，在相同条件下，两者同时刺激内皮细胞所产生的细胞数目比采用单独任何一种多2～8倍。
　　
　　3．2　增加血管的通透性：VEGF能够增加血管的通透性，主要作用于毛细血管后静脉和小静脉，使大量血浆蛋白和纤维蛋白原渗出到血管间隙，外渗的纤维蛋白原沉积形成蛋白凝胶，改变了细胞外基质，为促进血管生成和支撑新生血管提供暂时性基质；VE6F、bFGF、PDGF诱导血管内皮细胞增殖、迁移和趋化，最终从母血管长出新生血管，通过肿瘤基质逐渐向肿瘤内生长。VEGF对血管具有极强的通透性，其效应比组胺强5 000倍，这种快速(5min)而短暂(仅持续30min)的通透作用不伴有肥大细胞的颗粒减少，也不能被抗组胺类药物所阻断。一般认为，VEGF增加血管通透性的作用可能是通过增强血 管内皮细胞中的囊泡小体(vesiculo－vacuolal organelie)功能而产生的。VEGF的血管通透作展机制与Ca依赖性通道、血小板活化因子的合成、诱导内皮细胞穿孔、NO及前列环素、内皮细胞膜表面小凹介导等有关。因此，瘢痕疙瘩的胶原结节常常围绕血管分布，VEGF的增多还可能与瘢痕疙瘩瘤样增长有关。
　　
　　3．3　促进血管形成：不论在生理还是病理情况下，VEGF对血管生成都起非常重要的作用。肿瘤生长和转移都离不开血管生成，而VEGF是目前已知活性最强、专属性最高的血管生成因子，其他血管生成因子大都通过增强VEGF的表达产生血管生成作用。
　　
　　3．4　血管维持功能：VEGF可以刺激人或动物的内皮细胞产生NO并使其浓度呈剂量依赖性增加，从而起到一个血管维持功能。Dot认为VEGF不仅促进血管生成，而且能保护新生血管存活，直到血管被周细胞包被后，血管才可不依赖VEGF而存活，说明VEGF在血管生成及成熟过程中起重要作用。
　　
　　4　VEGF在瘢痕疙瘩中的表达
　　
　　瘢痕疙瘩多继发于皮肤损害，表现为在原皮损部位瘢痕增生的同时，不断向周围正常皮肤侵袭性生长，且多较原病损范围扩大，故有人又称为愈合的人体皮肤创伤反应或视为易感性个体在异常创伤愈合过程中形成的良性真皮肿瘤。姜笃银等研究发现瘢痕疙瘩组织学微血管呈现内膜过度增生和血管闭塞，伴有浅层血管过度扩张和出血征象。在瘢痕疙瘩浸润部肌成纤维细胞强表达VEGF和VEGF／KDR复合物，在老化部及正常皮肤有弱表达。VEGF在健康成人皮肤低表达有维持正常血管密度及其渗透功能，以满足低水平营养运输和新陈代谢需要；在瘢痕疙瘩部位呈现侵袭性生长的肌成纤维细胞持续过表达VEGF，可能是瘢痕疙瘩具有侵袭生长和异常瘢痕增生的分子病理基础。瘢痕疙瘩和早期增生性瘢痕组织中残留的腺体及其上皮细胞对bFGF和VEGF的异常表达可能是瘢痕增生的重要因素，对解释腺体丰富的部位好发增生性瘢痕和瘢痕疙瘩可能具有重要意义。不仅如此，血管内膜增生性闭塞还严重影响真皮、表皮连接区结构的再生和维持，最终丧失正常的表皮钉、真皮乳头和基底膜结构以及皮肤附属器，从而瘢痕疙瘩也由浸润部最终发展成为老化部。研究显示，VEGF比bFGF能更特异地促进血管再生和细胞间质形成，VEGF表达水平可能是瘢痕疙瘩瘤性增生的良好标志物。
　　烧、创伤组织修复过程中，当局部微环境发生变化，如持续低氧、严重感染、组织长期的高代谢反应以及异物的存留均可以使皮肤角质形成细胞、成纤维细胞分泌的促血管生长因子(如VEGF)增多；同时还可提高内皮细胞对促血管生成因子的反应，从而使新生血管的生长异常增多。新生的血管可为成纤维细胞合成胶原提供丰富的前体物质，而胶原的大量合成和沉积又可以压迫微血管使得局部氧浓度更加低下，故缺氧既可作为最重要的血管生成刺激因素，又能引起血管的增生，使之形成恶性循环。据此推测，这可能是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩血管异常生成的病理机制。VEGF基因的表达调控受细胞因子、瘤基因、抑瘤基因产物及缺氧等多种因素的调节，缺氧上调VEGF基因的表达水平已为众多研究所证实，并且其作用与缺氧诱导因子－1a(HIF 1a)密切相关。VEGF是较早发现的HIF－la的下游调节基因之一。VEGF基因5端增强予存在有与HIF－la结合的序列一缺氧反应元件(HRE)。缺氧时HIF-la积聚并且与DNA结合活性增加，HIE－la与VEGF基因的HRE结合后，促进VEGF表达。因此认为瘢痕内缺氧环境诱导HIF－la表达，HIF－la通过上调VEGF表达，促进血管生成、改善供氧，从而减轻瘢痕内缺氧状况。组织细胞受缺血缺氧刺激将上调VEGF等生长因子mRNA表达。
　　
　　5　展望
　　
　　综上所述，VEGF及其受体过表达可能与瘢痕疙瘩侵袭生长有关，异质性肌成纤维细胞异常表达VEGF和VEGF／KDR复合物可能通过旁分泌方式刺激血管内皮细胞增殖分裂来体现瘢痕疙瘩肿瘤侵袭性生长特性，阻断其生物学作用可能对临床治疗有积极意义。
　　肿瘤的生长离不开血管生成，抑制肿瘤新生血管可能成为治疗肿瘤的一种有效方法。能否通过抑制血管新生来达到治疗瘢痕疙瘩是值得研究的课题，根据文献报道对这方面的研究较少。目前针对VEGF及其受体进行抑制肿瘤新生血管治疗主要分三类：①是利用抗体中和VEGF，降低血液中VEGF浓度。Kim将横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤及多形性恶性神经胶质瘤接种于裸鼠，然后注入VEGF单克隆抗体，瘤体显著减小；②则针对VEGF受体，阻断信号传导，从而抑制肿瘤新生血管生成。如Millauer等利用无生物活性的flk－1／KDR片段，与有功能的flk－1竞争，抑制信号传导。该实验中，对人卵巢腺癌SK－OV－3、肺癌calu－6、胶质母细胞癌U－87T、表皮样瘤A－431的抑制率分别达到84％、91％、86％及93％；③利用与毒素结合的VEGF，通过配体受体结合，选择性杀伤表达VEGF受体的内皮细胞。Ramakrish nan等将白喉毒素(DT385)与VEGF结合形成复合体，在体外该复合体可抑制flk－1阳性的内皮细胞株(Py－4－1)：在体内该复合体可抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的绒毛尿囊膜的血管生成。因此在其他疗法难以奏效的情况下，干扰肿瘤的旁分泌途径可提供一个新的治疗肿瘤手段。
　　VEGF及其相关受体的深入研究有助于人们清楚了解血管形成的基本过程，为肿瘤及组织增生的预后开辟新途径，而监测血清中VEGF的变化可为实施基因治疗提供生物学指标。VEGF作为一种特异的作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，与内皮细胞的Fld、KDR及Flt4受体具有高度的亲和力，在调节血管生成及治疗应用方面起一定作用，针对其促进血管生成的特点，开发利用某种外源性干预因素，在需要抑制血液供应的肿瘤及组织增生等疾病中，使其低水平表达甚至完全不表达。充分利用其特性，完善其生理功能，更好地应用于临床，将是目前和今后研究的方向。