基于16S,rDNA,测序研究新西兰兔腹腔镜探查术后腹腔微生物群落多态性改变

来源:新西兰移民 发布时间:2023-02-16 点击:

张平平,吴文斌,曹 奇,曲 卓,王 培 (. 海军军医大学药学系药理学教研室, 上海 00433;
. 宁夏医科大学药学院,银川750000)

随着腹腔镜技术在普外科、妇科、泌尿外科等领域的广泛应用,在一些外科疾病如胆囊结石,阑尾炎,子宫肌瘤的治疗上,腹腔镜手术正在逐渐取代传统开腹手术。较传统手术而言,腹腔镜手术具有较高诊断准确率和治疗能力[1],且具有手术出血量少、肠蠕动恢复早、术后疼痛轻、术后恢复快、下床活动时间早、住院时间短、手术口美观、术后并发症降低等优势[1-2]。然而,无论是传统手术和腹腔镜手术,术后感染依然是影响患者预后的重要并发症。对于腹腔镜手术如何直接改变腹腔微生物群落种类及数量,目前还没有相关报道。

通过DNA 测序对微生物种群进行鉴定(菌种鉴定)是比传统生化鉴定更为先进、更为准确的鉴定方法。16S rDNA 是编码原核生物(主要为细菌)核糖体小亚基rRNA(16S rDNA)的DNA 序列,长度约为1 540~bp,存在于所有细菌染色体基因组中。16S rDNA 分子大小适中,突变率小,目前是细菌系统分类学研究中最常用的基准序列。16S rDNA 测序不依赖菌种本身的性质,使得它对所有菌种均可使用。通过对16S rDNA 的测序,可以快速、直观地明确细菌群落多样性的变化。

本研究通过制作新西兰兔腹腔镜探查术模型,对术后动物腹腔积液进行细菌16S rDNA 测序,对比分析腹腔积液中的微生物多态性,探索腹腔镜术后的微生物变化情况,可为腹腔镜手术的术后感染提供有效防治依据。

1.1 动物

雄性2 月龄新西兰兔6 只(上海甲干生物科技有限公司),体重约为2 kg,分别设置模型组(n= 3)和对照组(n= 3)。

1.2 仪器

ABI GeneAmp® 9 700 型PCR 仪;
NanoDrop2000型分光光度计;
CQZ2000720 型便携一体式电子腹腔镜,腹腔镜镜头型号为J1000B 型、J1030B 型(上海卓外医疗电子科技有限公司);
手提式高压蒸汽灭菌器DSX-24L-I(上海申安医疗器械厂)。

1.3 药物与器材

2%戊巴比妥钠溶液(0.4 g 戊巴比妥钠粉末溶于20 ml 0.9%氯化钠注射液);
碘伏溶液;
液氮;
0.9%氯化钠注射液;
手术器械(打孔器、手术刀、组织剪、血管钳、镊子、布巾钳、圆针三角针、手术单)。

2.1 动物分组

随机将6 只新西兰兔分成两组,分别设置模型组(n= 3)和对照组(n= 3),模型组麻醉后给予腹腔镜探查术,术后关闭腹腔;
对照组麻醉后开腹,然后关闭腹腔。

2.2 制作模型

对模型组新西兰兔称重,耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠(剂量1 ml/kg),麻醉成功后(呼吸平稳,角膜反射消失,身体肌肉松软),脱毛备皮,固定,生理盐水清洗皮肤,碘伏溶液消毒皮肤3 次(范围为伤口周围15 cm)。铺手术巾,铺巾钳固定。沿腹正中线上切开皮肤,向下分离肌肉筋膜,切开腹膜,腹腔镜打孔器深入腹腔,插入腹腔镜套筒。将腹腔镜沿腹膜伸进去,到达肝脏表面,探查肝脏及胆囊约2 min。取出腹腔镜及套筒,消毒手术区域,关闭腹腔,缝合手术切口,敷料固定。对对照组进行相同操作,但不进行腹腔镜探查术。待新西兰兔麻醉苏醒后,送回动物饲养中心饲养。

2.3 组织取材

腹腔镜术后模型制备一周后,动物取材。新西兰兔称重,备皮,分别对模型组动物和对照组动物固定、消毒、铺巾,沿腹正中线行5 cm 切口,打开腹膜腔,用无菌注射器深入到腹腔后部最低处,吸取约1.5 ml 腹腔液体,放入相应编号的EP 管中(并备份),液氮冷藏,随后进行16S rDNA 测序。

2.4 细菌16S rDNA 测序

根据 E.Z.N.A.® soil DNA kit (美国Omega Bio-tek公司)进行腹腔液体微生物群落的DNA 抽提,使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rDNA 基因V3-V4 可变区进行 PCR 扩增。在Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台(美国Illumina公司)进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。使用Fastp 软件对原始测序序列进行质控,使用Flash 软件进行拼接后,在美吉生物的I-Sanger平台上进行生物信息学分析。

3.1 模型组相比于对照组微生物群落种类增加

以最小二乘法对样本做判别分析(PLS-DA),寻找物种丰度矩阵和样品分布/分组信息的最大协方差,在门水平和种水平上,模型组样本与对照组样本组内聚合良好、组间区分明显(图1A、图1B)。结果显示为两组样本细菌的种类均一度良好。对两组样本数据做Venn 图分析,显示两者共有的OTU数目为957,模型组OTU 数目为2 206,对照组OTU 数目为592。模型组腹水OTU 含量高于对照组,表明模型组细菌种类较对照组明显升高(图1C)。

图1 模型组与对照组样本聚合度与OTU 含量

3.2 新西兰兔腹腔镜手术后细菌种类和数量均增加

对样本数据进行α 多样性分析,菌落丰富度Sobs 及Ace 值越高提示微生物群落丰度越高,结果显示模型组比对照组微生物群落丰度更高(图2A、图2B)。在微生物群落多样性分析中,Shannon 指数提示,数值越高多样性越大;
Simpson指数提示,数据越小多样性越大。得出模型组在微生物群落丰度和多样性方面均高于对照组(图2C、图2D)。从Alpha 多样性指数表中可得出同样的结论(表1)。

图2 两组样本微生物种类及数量变化情况

表1 Alpha 多样性指数表

通过对样本的OTU 分类学分析,对样本测序结果中的菌种、菌属等进行聚类,通过对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析,在丰度-均匀度曲线中,水平方向是物种丰度,曲线在横轴上的宽度越大,提示丰度越高。曲线的形状反映了物种的均匀度,曲线越平缓,物种越丰富。模型组相对于对照组曲线宽度更宽,更平缓。提示模型组细菌种类数量以及含量高于对照组(图2E)。

3.3 模型组的杂菌数量及其他菌群高于对照组

对样本数据进行微生物组成成分分析,在对照组中其他菌群数量占整体菌群数量的35.08%(图3A),而模型组其他菌群数量占整体菌群数量的65.04%(图3B),说明经过腹腔镜手术后,不明原因的其他菌群数量升高。模型组较对照组菌群占比升高的菌群有出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌等。由此得出结论:腹腔镜手术后杂菌的数量显著增加,且以出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、 正皮氏罗尔斯顿菌等升高为主。

图3 微生物菌群组成成分比较

3.4 新西兰兔腹腔镜手术后巴斯德菌明显增加。

微生物组在目、科、属、种水平上进行物种差异性分析。在目水平上,得出以下微生物群落升高:巴斯德菌目、马赛菌目、沙壤土杆菌目、莫拉菌目、奈瑟菌目、山羊海藻百伯史坦菌目、冢村氏菌目;

在科水平上,发现以下微生物群落升高:巴斯德菌科、奈瑟菌科、紫杉霉菌科、热苜蓿菌科、冢村氏菌科、膜杆菌科、虎蛆科、Akk 菌科 、韦荣氏球菌科;
在属水平上,发现以下微生物群落升高:巴斯德菌属、马赛菌属、莫拉菌属、奈瑟菌属、山羊海藻百伯史坦菌属、冢村氏菌属;
在种水平上,发现以下微生物群落升高:
巴斯德菌、类芽孢杆菌、奈瑟菌、拉姆利杆菌、马赛菌、赤藓科菌、冢村氏菌、马赛菌、链球菌属。通过分析,发现在目、科、属、种上模型组均有增长且增长较为明显的菌种为巴斯德菌(图4A~图4D)。

图4 模型组高于对照组微生物群落的情况

随着腹腔镜手术大量应用于临床,相比于传统手术而言,术后感染虽有所下降[3],但由于植入材料的应用,腹腔术后感染发生率依然很高。有研究表明,在腹腔镜术后患者的术后感染中革兰阴性菌占半数以上,以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、嗜血菌属为主;
革兰阳性菌以溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌为主;
真菌以念球菌属、光滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌为主[3-5]。在这些术后感染的病人中,感染的部位主要集中在肺部、腹部和尿道[5],从而引起相应术后并发症。

本研究通过对新西兰兔进行腹腔镜探查手术,发现模型组与对照组在样本菌群的聚合度良好,并且在模型组中,菌群的多样性和丰度比对照组高。在进行两组样本微生物群落对比分析中发现,在属水平上模型组的其他菌群占比由35%上升至65%。表明菌群群落数量在腹腔镜手术术后显著升高,且以草酸杆菌科、有益杆菌、巴斯德菌、瘤胃球菌、黄杆菌升高为主,其中巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌、黄杆菌导致人感染疾病。研究发现,巴斯德菌是一种来源于动物的革兰阴性球菌,可引起蜂窝织炎、腹膜炎、菌血症、心内膜炎、脑膜炎和化脓性关节炎等疾病[6],严重者病死率可达到31%[7]。瘤胃球菌是一种革兰阳性厌氧菌,是人类正常肠道菌群的一员[8],可以导致炎症性肠病[9]。正皮氏罗尔斯顿菌是革兰阴性杆菌,容易侵袭免疫功能低下的患者,可导致严重的菌血症和肾盂肾炎[10]。有研究表明,在195 名呼吸功能衰竭患者中有黄杆菌定植,但均未出现相应的并发症。微生物菌群物种差异性分析发现,在科、目、种、属水平上,模型组较对照组在巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌、热苜蓿菌、叶绿体、噬纤维菌等均有不同程度上升,而其中巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌可导致人类发病。据相关研究显示。冢村氏菌是一种革兰阳性、专性需氧、弱抗酸细菌,可导致人体肺部感染[11]。奈瑟菌可导致人体感染尿道炎、脑膜炎[12]。

本研究发现巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌、黄杆菌、奈瑟菌、冢村氏菌在模型组呈现显著上升趋势,这些菌种可引起腹腔、尿道、肺部感染,出现严重的腹膜炎、肠梗阻,尿道炎以及脑膜炎,甚至导致病人死亡,对腹腔镜腹腔感染控制有一定的指导意义。由于本次为动物实验,可能存在手术室条件有限,手术者操作不规范等将细菌带入腹腔情况,能否在临床病人身上得出同样的结论,还需要做进一步的研究。

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