鸡新城疫免疫检测程序

　 教学实习内容

　鸡新城疫的免疫检测

　目的：系统掌握鸡新城疫的抗体检测技术。

　实验材料：新城疫疫苗、待测鸡蛋、生理盐水、5%柠檬酸钠、1%鸡红细胞悬液、胶头滴管、注射器、锥形瓶、15ml离心管、试管、96孔V型板、离心机等

　1.1%鸡红细胞悬液的制备

　（1）每组采取3ml左右健康鸡静脉血，迅速注入装有约0.3-0.4ml抗凝剂的离心管内，轻轻颠倒混匀；

　（2）加入适量生理盐水，混匀，3000rpm*10min，吸弃上清液和红细胞沉淀上层的白细胞层

　（3）加入适量生理盐水，重悬红细胞，3000rpm*10min，吸弃上清液。如此，重复3次。

　（4）量取红细胞沉淀的体积，用生理盐水配成1%的红细胞悬液，待用。

　2.HA试验

　根据所用NDV液的凝集价，配制4单位病毒液。

　3.HI试验

　（1）待测卵黄样品的制备：用镊子敲破鸡蛋小头，将蛋清倒去，留蛋黄在蛋壳内；吸取0.5ml生理盐水，放入小试管内；去掉部分蛋壳，用1ml注射器（不带针头）吸取蛋黄0.5ml，加到有生理盐水的试管内，混匀（避免其很多泡）待检。

　（2）按照检测血清抗体的方法检测卵黄中的抗体。

　（3）判定和记录所检测鸡蛋的卵黄抗体效价。

　结果与分析

　对所测得的结果进行分析，确定该鸡群目前的免疫状态，并对生产提出合理建议或给出科学指导。

　分析并指出影响本实验结果的主要因素。

　二．传染病的分子生物学检测——PCR检测（以PCV2为例）

　1.DNA提取：

　将猪肝脏称重后，按照1:3（WV）的比例加入PBS，μL提取DNA。

　取冻融、离心后的组织悬液/血清300μL，加入300 μL细胞裂解缓冲液和5 μL的蛋白酶K(20 mg/mL)，混匀，置50 ℃消化2 h，每隔30 min，剧烈震荡一次；加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀后，4 ℃ 12000 rpm 离心10 min；用酚：氯仿：异戊醇（25:24: l）重复抽提一次；取上层水相转入一新的l.5 mL eppendorf管中，加入2倍体积冰预冷的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠（pH 5.2），室温放置30 min 以沉淀基因组DNA；4 ℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；用75%乙醇1 mL 洗涤沉淀，4 ℃ 12 000 rpm 离心min后，上清，μL含RNaseA(20 μg/mL)的TE溶解DNA沉淀，直接用于检测病毒DNA或-20 ℃保存待测。

　2.PCR检测：

　将所提取的DNA用特异性引物进行PCR扩增检测组织中PCV2。

　25 μL反应体系如下：

　10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL

　10 mmol/L dNTPs 2 μL

　25 pmol/μL上下游引物各 0.5 μL

　DNA模板 2 μL

　Taq DNA聚合酶 0.5 μL

　三蒸水 17 μL

　反应程序如下：94 ℃ 变性3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环32次；72℃ 延伸10 min。

　3.琼脂糖凝胶电泳

　（1）1.5%琼脂糖凝胶的配制：称取1.5g琼脂糖，加入到锥形瓶中，加入100ml电泳液。微波加热4min。

　（2）制胶：准备好制胶板，待琼脂糖溶液温度下降到60度左右时，将胶液倒入制胶板内。

　（3）上样：拔去梳子，将凝胶放入电泳槽内，使电泳液浸没凝胶。取8ulPCR产物与1ul的上样缓冲液混匀后，加入凝胶孔内。

　（4）电泳：加样孔一端置于负极端，打开电泳仪，电泳30min。由于DNA带负电，所以将会看到样品向正极涌动。

　（5）观察结果：电泳完毕后，关闭电泳仪，取出凝胶，在紫外灯下观察扩增条带是否与预期大小相同（本实验中扩增的DNA条带大小为417bp）。

　提前上网查找提取DNA及PCR扩增原理

　1%红细胞

　1%红细胞

　被检鸡蛋卵黄