纳米微囊技术【纳米微囊－ＶＥＧＦ复合体对创伤组织中ＶＥＧＦ、受体ＫＤＲ的表达及微血管形成的影响】

　　[摘要]目的：研究纳米微囊－VEGF复合体对创伤组织中VEGF、受体KDR以及微血管表达的影响，探讨其促进损伤组织修复的作用机理。方法：将纳米微囊－VEGF复合体作用于兔耳慢性创面，利用反转录PCR方法观察各组术后1、3、7、10、14天创面组织中VEGF及KDR mRNA表达的变化；利用免疫组化染色观察创面肉芽组织中VEGF蛋白表达及微血管的变化。结果：VEGF mRNA在Nw(非缺血创面组)和CW+VEGF组(转基因组)3天后的表达水平均高于其在CW组(慢性创面组)相应时间点的表达水平，P＜0.05；KDR mRNA在NW组7－14天，CW+VEGF组3－14天的表达水平高于CW组，P＜0.05；VEGF蛋白表达变化与mRNA表达结果基本一致；与CW组相比，7天后微血管计数在CW+VEGF组及NW组增加显著，P＜0.05。结论：外源性VEGF基因转染导致创面中VEGF及受体KDR的表达上调，并通过增加肉芽组织中微血管的生成促进了慢性创面的愈合。
　　[关键词]血管内皮生长因子；基因治疗；纳米微囊
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A　[文章编号]1008―645 5(2 007)04―0455―04
　　
　　血管内皮生长因子(vascular endothelia1growth factor，VEGF)是血管生成的一个关键调节因素，慢性创面中VEGF表达较正常创面下调而导致的血管生成的下降，被认为是慢性创面难愈合的重要原因。在外源性VEGF的应用中，蛋白注入给药方式由于存在价格昂贵、半衰期短、易水解和单次较大剂量使用可能会导致血流动力学改变等缺点，具有明显的局限性。
　　本实验采用新型材料纳米微囊为载体包裹VEGF质粒，通过基因转染方式促进慢性创面的愈合，并从蛋白及mRNA水平对创面VEGF、受体KDR的表达情况以及转基因后它们的表达变化进行了分析，对其作用机理进行探讨，为临床治疗慢性创面提供新的思路和理论依据。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料：VEGF、CD34单克隆抗体 (美国SantaCruz)；DEPC、APES胶、溴化乙锭、BSA(美国Sigma)；Trlzol试剂(英国GIBCO)；DTT、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂(美国Invitrogen)；PCR试剂盒(日本Kakara)；DAKO Envision?System试剂盒(丹麦DAKO)；DNA分子量Marker DL2000(日本Kakara)。引物均由上海Sangon公司合成：VEGF上游引物：5’TGC TGC TCT ACC TCC ACC AT3’，下游引物：5’TTG GTC TGC ATT CAC ATT TG3’。KDR上游引物：5’GCC GGT GCC CTG TGC TTT CC3’，下游引物：5’TCC CCT GCA AGT AAT CTG　AA3’。β-actin上游引物：5’GAG GCC CAG AGC AAG AGAGG3’，下游引物：5’CCA GAG GCA TAC AGG GACAA3’。
　　1．2　纳米微囊－VEGF复合体的制备：参照彭湃、韩岩等报道方法制备。
　　1．3　模型制作及取材：健康新西兰白兔25只，48－60月龄，体重3.9－5.0kg(第四军医大学实验动物中心提供)，动物模型构建及分组详见以往报道。据此将本实验共分为3组：转基因组(一侧兔耳慢性创面滴加纳米微囊VEGF复合体，以CW+VEGF表示)、慢性创面组(另侧兔耳慢性创面滴加纳米微囊空载质粒，以CW表示)、非缺血创面组(双侧兔耳非缺血创面滴加纳米微囊一空载质粒，以NW表示)。于术后1、3、7、10、14天，每时间点随机处死5只动物。取材方式：半数创面切取1cm×1cm正方形组织块，中性福尔马林固定、石蜡包埋。其余创面用直径7mm的皮肤打孔器，在耳软骨表面环形切取创缘皮肤及肉芽组织，每创面取100mg组织迅速放入-70℃冰箱中保存，用于RT―PCR。
　　1．4 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：利用TRIzol试剂盒按说明提取组织总RNA。反转录酶合成单链cDNA。以93℃ 1min，适合的退火温度30s，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸8min，30个热循环的程序进行PCR扩增。扩增产物经电泳、染色、凝胶成像系统检测后，用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测定。
　　1．5 VEGF、CD34免疫组织化学染色：石蜡切片常规免疫组化染色。其中一抗为VEGF、CD34单克隆抗体，稀释度分别为1：50和1：100，同时设立已知阳性对照、阴性对照、空白对照、正常未免疫小鼠血清替代对照。
　　1．6 创面微血管计数：孤立的棕色血管内皮细胞或细胞簇代表l条单独的微血管。根据Pareek等的计数方法，先在低倍(100X)视野内选择染色密度高的区域，然后在高倍(200X)视野内计数3个视野，取平均值作统计学处理。
　　1．7 图像分析：先在低倍镜(100X)下筛选出染色较强的区域，然后在其中随机选取5个高倍视野(200X)，LaicaQC500图像分析仪测定其透光度，值越小，则染色密度越高。取平均值，设定染色背底的透光度为100，阳性染色的密度与背底密度的比值作为每张切片免疫组化染色的相对密度。
　　1．8 统计学处理：所得数据采用SPSS10.0统计软件对数据进行ANOVA和post―hoc检验，分析组间和两两差异，显著性差异标准α为0.05。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结果：VEGFmRNA在NW和CW+VEGF组3天后的表达水平均高于其在CW组相应时间点的表达水平，具有统计学意义，P＜0.05。KDR mRNA在NW组7-14天，CW+VEGF组3-14天的表达水平显著高于CW组，P＜0.05。
　　2．2 VEGF免疫组化染色结果：VEGF在创缘主要表达于新生表皮层，炎细胞有少量表达，3天后血管内皮细胞及成纤维细胞阳性信号逐渐增强，阳性颗粒定位于胞浆。在CW+VEGF组及NW组表达较强，而CW组阳性信号较弱。图像分析结果见图5，CW组虽然随时间的延续表达上调，但曲线变化较平缓，其数值显著低于其他两组，P＜0.05。NW组3天后表达增高，7-10天达到峰值。CW+VEGF组自1天后表达升高明显，7天时达到峰值。
　　2．3 创面微血管计数结果：CD34染色显示7天后CW+VEGF组及NW组微血管数量丰富，而CW组微血管数量较少。计数结果表明，从1-14天各组微血管数量逐渐增加，在7天后CW+VEGF组及NW组与CW组之间的差异具有统计学意义，P＜0.05。 　　
　　3 讨论
　　
　　在影响慢性创面形成的诸多因素中，内源性生长因子的严重匮乏是导致慢性创面难愈合的一个重要原因。在急性创面有数种促进愈合的生长因子的高水平表达，而慢性创面中会明显减弱甚至缺失。Cooper证实在褥疮创面中PDGF、bFGF、EGF和TGF-B表达水平明显低于急性创面。同样，在受损创伤愈合鼠模型中PDGF及其受体表达也下调。许多证据表明VEGF在创伤愈合中的表达水平与创伤修复的发展及预后有着密切的关联。对大鼠创伤皮肤内VEGF表达的免疫组化研究表明，创伤组于伤后12hVEGF表达开始增强，以24-48h表达最强。对放射性溃疡的研究证实，辐射损伤的皮肤组织细胞合成分泌VEGF的功能在溃疡形成前被电离辐射轻度激活，在溃疡形成后，VEGF蛋白表达水平明显低于正常创面组，是溃疡形成、发展及难愈合的原因之一。
　　从我们前期实验中证实非病毒载体纳米微囊-VEGF复合体能明显促进慢性创面愈合。在本实验中，慢性创面组VEGF虽然随着时间的延续表达上调，但数值显著低于其他两组，说明在慢性创面中VEGF低表达可能是导致创面难愈合的一个重要原因。非缺血创面自3天以后VEGF表达显著增高，7天至10天达到峰值，14天时仍维持较高水平，这有助于新生血管化，可能是该组创面能够正常愈合的一个重要保证。外源性VEGF基因转染创缘细胞后，表达在1天后显著上调，可以推断动物体内转染成功。
　　VEGF的调控机制并不十分清楚。缺氧导致VEGF表达增高与其激活VEGF基因启动子AP-1区有关，由于创面形成会造成不同程度的组织氧分压下降，因此本实验中各组均可能因创伤后局部低氧而上调VEGF表达。同时一些细胞因子对VEGF表达有正调节作用，而创伤修复各阶段均有上述因子的表达。可以推测多种细胞因子可能通过激活某种特定的信号通路而影响VEGF的转录及翻译过程。慢性创面多种生长因子表达的减弱甚至缺失而下调了VEGF的表达，使其表达曲线与非缺血创面差异显著。
　　实验选择KDR作为受体研究对象，是因为Flt-1与VEGF有高度亲和力，但其表达水平较低，不易检测。在创伤形成后三组KDRmRNA表达水平都有不同程度提高，但提高的幅度是有明显差异的，其中慢性创面提高幅度最小，而转基因组上升幅度最大。KDR出现与VEGF一致性的表达升高更有利于两者充分的结合而发挥其生物学效应，比如可以增强血管发生信号在内皮细胞的传递，进一步促进血管生成，有利于创面愈合的进程。
　　综上所述，外源性VEGF基因转染可以使创面中VEGF及受体KDR的表达上调，并通过增加肉芽组织中微血管的生成促进创面的愈合。但尚有一些问题值得深入探讨，如外源性VEGF上调KDR表达是在何种水平通过何种信号传导通路需待进一步的研究。