CXCR4靶向shRNA质粒载体的制备和体外鉴定 靶向治疗要多少钱

　　[摘要]目的:设计并构建CXCR4靶向shRNA质粒载体,转染黑色素瘤细胞株,验证shRNA对黑色素瘤CXCR4基因的沉默效应。方法:设计合成CXCR4特异性shRNA,将其插入pSilencer质粒载体,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株,抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达,应用Western blot法检测CXCR4蛋白变化。结果:成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体及稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆。阳性克隆测序结果表明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞MV3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。结论:脂质体介导shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达,有望为转移性黑色素瘤的靶向基因治疗提供一条新途径。
　　[关键词]黑色素瘤;趋化因子受体CXCR4;shRNA;质粒
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)08-1167-04
　　
　　Construction and in vitro identification of CXCR4 target plasmid vector of short hairpin RNA
　　WU Bao-jin1,2,JIANG Hua2,LI Wen-peng3,WU Jian-ming2,ZHANG Ying-fan2,DING Wei1
　　(1.Department of Plastic Surgery,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200003,China; 2.Department of Plastic Surgery,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University; 3. Department of Plastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo construct a CXCR4 specific shRNA recombinant plasmid vector and identify its inhibiting effect on the gene expression of CXCR4 in melanoma cell lines. MethodsA CXCR4 specific recombinant plasmid vector was prepared and transfected into the cultured MV3 cell line with lipofectamine 2000. RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of CXCR4, respectively.ResultsCXCR4 specific shRNA was constructed and transfected into the MV3 cell line. Agarose gel electrophoresis confirmed the vector had been inserted in the production of PCR, and sequencing result showed that composite CXCR4-shRNA inserting correctly in the positive clone. Both the CXCR4 protein and mRNA expression in the CXCR4-shRNA group were significantly lower than that of the control group.ConclusionCXCR4-shRNA can be highly effectively transfected into melanoma cell, and induced post-transcriptional gene silencing of CXCR4, which may become a potential target in the prevention and treatment of invasion and metastasis of melanoma.
　　Key words:melanoma;chemokin receptor CXCR4;short hairpin RNA; plasmid
　　
　　RNA干扰 (RNA interference, RNAi)是近年发现的一种调节mRNA的生物学现象,它能使基因表达的mRNA被相应的双链RNA分子敲除,从而引起转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS),其效果远强于正义和反义RNA[1]。目前研究表明,参与这种RNAi作用的主要分子是双链RNA,在细胞内以21-23个核苷酸的形式发挥作用,而且己有人工合成双链siRNA,具有明显敲除相应基因mRNA的效果[2]。
　　近年研究发现,CXCR4在某些肿瘤细胞中表达,并可能在侵袭转移中发挥着重要作用[3-6]。在黑色素瘤侵袭转移中对其正相关基因的抑制,是值得探索的思路之一。本研究通过构建CXCR4靶向shRNA的质粒载体,转染黑色素瘤细胞株,验证shRNA对CXCR4的沉默作用,为后期进一步研究CXCR4基因沉默阻断SDF-1/CXCR4信号转导途径对黑色素瘤侵袭转移的影响奠定基础。
　　
　　1材料和方法
　　1.1实验材料:MV3细胞株系人转移性黑色素瘤细胞株,B16F10系小鼠高转移性黑色素瘤细胞株均购自中国科学院上海细胞所细胞库。pSilencer 3.1-H1 neo质粒购自Ambion公司,内含四环素Ampr抗性基因和人U6启动子以及新霉素抗性筛选标记。PCR引物由上海申工合成。
　　1.2人CXCR4 shRNA脱氧寡核苷酸片段shRNA设计:从NCBI GenBank数据库获取CXCR4 cDNA的完整序列。根据siRNA设计原理和哺乳动物真核细胞siRNA的Tuschl AA-19nt的设计原则,应用Ambion公司提供的在线工具,设计一对shRNA序列的模版DNA和无关对照shRNA模版DNA。根据在线从CXCR4基因的mRNA序列中筛选1条shRNA靶序列,并合成相应的正义和反义DNA 链模板。以上模板DNA链寡核苷酸包括BamHI酶切位点、19nt正义序列、RNA PolⅢ终止子和HindⅢ酶切位点。同时设计好阴性对照模板,设计的siRNA序列在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索后排除与人体其他任何mRNA有同源性。对照组序列不针对人体任何mRNA 序列,确定序列的唯一性。
　　1.3合成DNA片段和双链模板DNA:按照上面CXCR4-shRNA正反义链序列合成DNA片段。将合成片段分别溶于双蒸水中,配制成100pmol/μl的溶液。每条正义链分别与其反义链退火后,形成一个限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ酶及黏性末端。12%非变性PAGE凝胶检测双链形成效率,凝胶成像仪检测电泳条带。
　　1.4CXCR4-shRNAR表达质粒载体的构建及鉴定:BamHI和HindⅢ酶切处理pSilencerTM 3.1-H1 neo表达质粒载体(AM5770; Vector Size: 4285 bp; 20rxns),形成线性片段,除去酶切下来的小片段而纯化,使其不发生自身连接。用T4 DNA连接酶将退火后的双链核苷酸片段插入线性化载体。使用BamHI和HindⅢ酶切处理pSilencerTM 3.1-H1 neo表达质粒载体进行酶切消化。
　　1.5连接(克隆制备)和转化:将退火形成双链DNA与经BamHI和HindⅢ酶切的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体连接。于4℃ 12h连接反应,制备克隆连接液,准备转化。用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加2μl 连接液,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上90s。快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却l～2min。每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性的 SOB琼脂培养基上。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿,于37℃培养,16h。阳性克隆PCR鉴定后菌液送测序。选择测序鉴定正确的克隆,将保存的正确的单克隆菌液接种于2～5ml抗性LB培养基中,37℃培养,按照实验说明进行阳性克隆质粒抽提筛选。设转染CXCR4-shRNA表达载体的细胞为实验组,转染无关对照shRNA载体的细胞为无关对照组。
　　1.6RT-PCR检测CXCR4 mRNA表达:以人MV3细胞作为空对照,分别取实验组、无关对照组和空白对照组细胞,按Trizol试剂说明书操作提取细胞总RNA,用于扩增人CXCR4 cDNA。PCR引物由上海申工合成。PCR扩增后行1%琼脂糖凝胶电泳,用图像扫描仪拍照并进行条带灰度分析,以CXCR4与GAPDH的比值代表其相对含量。
　　1.7Western blot 检测CXCR4蛋白的表达:取实验组、无关对照组和空白对照组细胞,加入细胞裂解液,提取细胞总蛋白,用BC试剂盒检测蛋白质浓度。取PBS、各样品10μl,加DW990μl;取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml;向各管加入2.5ml D试剂混匀,静置10min;迅速加入酚试剂0.25ml,混匀37℃水浴30min;721分光光度计650nm,比色,SO标准管调零;最后稀释为4μg/μl,加载样缓冲液后终浓度2μg/μl,上样量30～80μg/泳道。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样50μg,经电泳、转膜、封闭后,依次与CXCR4抗体(1:200)及HRP标记的二抗(1:500)反应1h,化学发光试剂曝光显影,紫外分光光度计扫描各条带灰度植值以反映蛋白质的表达水平。内参照为β-actin。
　　1.8统计学处理:采集数据以均数±标准差表示,SPSS10.0统计软件进行t检验,P0.05)。
　　2.6 shRNA对人转移性黑色素瘤细胞MV3 内CXCR4蛋白表达的影响
　　Western blot检测结果显示,实验组CXCR4-shRNA稳定转染MV3细胞后,CXCR4蛋白的表达明显被抑制(图6)。实验组、空白对照组和无关对照组中CXCR4蛋白的表达率分别为12.8%±2.3%、41.1%±1.9%和38.5%±2.7%。空白对照组和无关对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组较空白对照组其表达率显著下降(P 　　自然界中存在3种干涉mRNA的机制:反义RNA、核酶和RNAi[14]。siRNA 的优点在于:在抑制基因表达的效果上,双链RNA对靶基因的抑制效果至少比单链反义RNA的抑制效果强2个数量级。事实上,反义RNA的基因抑制效果可能取决于它形成dsRNA的能力。相对于反义RNA和核酶技术,RNAi沉默效果基本不受RNA二级结构的影响。在体外得到siRNA后再导入细胞内有两方面无法克服的缺点:siRNA进入细胞后容易被降解;进入细胞siRNA的数量不受控制。针对这种情况,出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。
　　shRNA通过载体导入细胞后,利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。shRNA最大的优势是利用载体上的抗生素标记可以建立相对稳定的长期基因沉默细胞株,或者通过病毒插入基因组中从而得到稳定的基因沉默表达株。此外,载体上的抗生素筛选还可以排除未转染的细胞,以避免混杂的未转染细胞中的目标基因mRNA干扰后继的定量检测结果。shRNA质粒载体除了可以做长期基因沉默,还可重复使用[15]。
　　本实验综合体内表达shRNA设计原则,由专业人员在线设计,以确保设计的siRNA序列的有效性。本实验采用质粒载体介导的shRNA转染效率高,稳定性好,对细胞的和组织的毒副作用小,在细胞中持续长期抑制靶基因的表达,适合基因治疗和长期研究。实验结果表明,以CXCR4为靶向的shRNA质粒载体能够有效下调CXCR4基因的表达,达到CXCR4基因沉默效应,为下一部分实验奠定了基础。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Sibley CR, Seow Y, Wood MJ. Novel RNA-based strategies for therapeutic gene silencing[J]. Mol Ther,2010,18(3): 466-476.
　　[2]Di Cesare S,Marshall JC,Fernandes BF,et al. In vitro characterization and inhibition of the CXCR4/CXCL12 chemokine axis in human uveal melanoma cell lines[J]. Cancer Cell Int, 2007,14(7):17.
　　[3]Lazennec G,Richmond A. Chemokines and chemokine receptors:new insights into cancer-related inflammation[J]. Trends Mol Med,2010,16(3):133-144.
　　[4]Wu X,Lee VC,Chevalier E,et al. Chemokine receptors as targets for cancer therapy[J]. Curr Pharm Des,2009,15(7): 742-757.
　　[5]Gelmini S,Mangoni M,Serio M,et al. The critical role of SDF-1/CXCR4 axis in cancer and cancer stem cells metastasis[J]. J Endocrinol Invest, 2008, 31(9): 809-819.
　　[6] Murakami T,Cardones AR, Hwang ST. Chemokine receptors and melanoma metastasis[J].J Dermatol Sci,2004,36(2): 71-78.
　　[7]Payne AS,Cornelius LA. The role of chemokines in melanoma tumor growth and metastasis[J]. J Invest Dermatol,2002,118(6): 915-922.
　　[8] Rubin JB. Chemokine signaling in cancer: one hump or two[J]? Semin Cancer Biol,2009,19(2): 116-122.
　　[9] Raman D,Baugher PJ,Thu YM,et al. Role of chemokines in tumor growth[J]. Cancer Lett,2007, 256(2): 137-165.
　　[10]马秀云,王喜梅,牛扶幼,等. SDF-1、CXCR4及ERKl/2在病理性瘢痕中的表达及临床意义[J]. 中国美容医学, 2009, 18(11): 638-1639.
　　[11]Hinton CV,Avraham S,Avraham HK. Role of the CXCR4/CXCL12 signaling axis in breast cancer metastasis to the brain[J]. Clin Exp Metastasis,2010,27(2): 97-105.
　　[12]Ashihara E,Kawata E,Maekawa T. Future prospect of RNA interference for cancer therapies[J]. Curr Drug Targets,2010,11(3):345-360.
　　[13]Tiemann K,Rossi JJ. RNAi-based therapeutics-current status, challenges and prospects[J]. EMBO Mol Med,2009,1(3): 142-151.
　　[14]Pushparaj PN,Aarthi JJ,Manikandan J,et al. siRNA,miRNA,and shRNA: in vivo applications[J]. J Dent Res,2008,87(11): 992-1003.
　　[15]Singer O,Verma IM. Applications of lentiviral vectors for shRNA delivery and transgenesis[J]. Curr Gene Ther,2008,8(6): 483-488.
　　
　　[收稿日期]2010-05-10 [修回日期]2010-07-14
　　编辑/张惠娟