松材线虫USP基因家族鉴定及生物信息学分析1)

谭瑞娜 郝昕理永霞马玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所)(东北林业大学)

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)作为松材线虫病的病原，严重威胁东亚和欧洲等地的森林生态系统安全[1]。截至2021年末，松材线虫病已在我国18个省731个县级行政区发生，发生面积171.65万hm2，导致1 407.92万株松树死亡，并且表现出向西和向北快速扩散的态势，造成巨大的经济损失和严重的生态破坏[2]。目前科研人员把研究重点聚焦于对松材线虫的防治和探索松材线虫病的致病机理，而对松材线虫发育相关机制的研究相对较少[3-4]。

泛素化调控是一个由泛素化和去泛素化协同调控的动态平衡可逆过程。去泛素酶(DUBs)是介导蛋白质去泛素化过程的蛋白质家族，它在生物体生长发育过程中发挥着重要作用[5]。作为去泛素化酶的一种，USP在生物体内细胞发育、信号传递、肿瘤发生和转移及一些免疫反应等方面均发挥着重要的作用[6]。在人体中USP7可以介导免疫信号传递、修复DNA损伤以及肿瘤细胞的扩散和转移[7-8]；
斑马鱼的USP5基因通过调节下游基因激活对病毒的免疫反应[9]。另一方面，一些USP基因还参与了生物体雌雄个体之间的分化，如人体中USP9Y基因与男性精子的产生密切相关[10]；
小鼠USP19基因参与调节雄鼠的骨骼肌的强度，促进雌雄个体分化[11]。此外，在对线虫的研究中发现，USP基因参与线虫和昆虫的免疫、细胞分化和胚胎发育[12-15]。但是目前尚未发现有关松材线虫泛素特异性蛋白酶的报道。

为探索USP在松材线虫免疫和发育过程中的功能，本文通过对松材线虫泛素特异性蛋白酶USP家族进行分析。首先通过松材线虫基因组数据筛选松材线虫USP家族成员，随后对其基因结构、理化性质、保守基序和蛋白结构进行分析，并分析USP在松材线虫各发育阶段中的表达模式。为进一步揭示USP家族成员在松材线虫生长发育过程中所发挥的重要功能提供理论基础。

1.1 松材线虫USP家族成员鉴定

首先通过NCBI基因数据库查询并下载秀丽线虫的USP基因序列，随后利用秀丽线虫USP基因序列在Wormbase数据库(https://parasite.wormbase.org/)中结合松材线虫最新全基因组SAMEA7232845的相关数据获得松材线虫USP候选基因序列[16]。随后在NCBI-Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[17]和Pfam(http://pfam.xfam.org/)[18]上鉴定所得候选蛋白序列是否具有USP保守结构域，删除冗余序列，获得松材线虫USP家族成员蛋白序列。利用在线软件Expasy(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)[19]分析松材线虫USP家族成员的理化性质。

为了解松材线虫USP家族成员与其他线虫中USP家族的进化关系，使用MEGA 11.0对8个秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)、8个马来丝虫(Brugiamalayi)、5个Caenorhabditisbriggsae和4个远交线虫(Caenorhabditisremanei)中的USP蛋白序列进行多序列比对，并根据多序列比对结果及校正的Akaike信息准则(AICc)和Bayesian信息准则(BIC)构建最大似然进化树，Bootstrap检验1 000次。比对结果通过iTOL在线工具(https://itol.embl.de/)进行美化。

1.2 松材线虫USP家族系统发育分析及保守基序

通过松材线虫基因结构注释文件提取松材线虫Bx-usps基因结构，利用在线软件GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)进行基因结构可视化分析[20]。同时，应用MEME在线网站(https://meme-suite.org/meme/)[21]对松材线虫USP家族成员的保守基序分布进行分析，motif数值设为5，其它参数默认，随后将最大似然树与MEME结果结合绘制基因结构图和保守基序结构图。

1.3 松材线虫USP家族染色体分布与结构

筛选gff3文件得到的基因家族成员在染色体的位置、起始和终止位点以及基因长度等信息，构建松材线虫基因注释文件。根据松材线虫基因注释文件，运用TBtools工具提取线虫基因密度信息[22]。随后对Bx-usps基因在染色体上的分布情况进行分析并绘制基因染色体分布图。应用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)[23]对蛋白三级结构进行预测。

1.4 松材线虫USP家族在线虫不同发育阶段中的表达谱

为探索松材线虫USP家族成员在线虫生长发育过程中发挥的具体作用，结合松材线虫USP家族基因在线虫不同发育阶段转录组数据(NCBI编号：PRJDB7519和PRJDB3458)[24-25]，获得19个松材线虫USP基因在线虫不同发育阶段中的表达值(FPKMs)，使用OmicStudio tools(https://www.omicstudio.cn)的Heatmap Plots工具对所得数据进行标准化处理与表达模式热图绘制[26]。

2.1 BxUSP家族理化性质

经过Wormbase数据库BlastX检索比对，及NCBI-Conserved Domains和Pfam对保守结构域验证后，从松材线虫基因组中获得19个USP家族成员，依据其与其他线虫的蛋白相似程度，将其命名为BxUSP1-BxUSP19(表1和表2)。由松材线虫USP家族成员理化性质结果可知，编码BxUSP蛋白的氨基酸个数平均为795.3个。BxUSP蛋白的分子质量平均为90.82 ku，分子质量最低的是BxUSP6(31.53 ku)，最高的是BxUSP18(15.89 ku)。BxUSP蛋白家族的理论等电点在4.77～9.43范围内分布，19个BxUSPs蛋白均为亲水蛋白。

表1 USP家族成员与其他线虫USP家族成员对照表

续(表1)

表2 家族成员蛋白质理化性质

通过松材线虫与秀丽线虫、马来丝虫、Caenorhabditisbriggsae、远交线虫等4种线虫的USP蛋白序列构建的系统进化树分析(图1)，明确了松材线虫USP基因家族成员间的关系。根据进化树聚类分析发现Bx-USP3与Bma-USP3聚为一支；
Bx-USP4和Bx-USP16与其他线虫的USP39聚为一支；
Bx-USP5与其他线虫的USP5聚为一支；
Bx-USP1和Bx-USP12聚为一支；
Bx-USP2、Bx-USP8和Bx-USP18和其他线虫的USP48聚为一支；
Bx-USP11和Bx-USP13聚为一支；
Bx-USP14与其他线虫的USP14聚为一支；
Bx-USP15与Bma-USP33聚为一支；
Bx-USP17与其他线虫的USP46聚为一支；
Bx-USP9、Bx-USP10和Bx-USP19与其他线虫的USP50聚为一支；
Bx-USP6和Bx-USP7单独为一支。表明线虫USP家族进化相对保守，且发现松材线虫USP家族在数量上多于土壤线虫和动物寄生线虫的USP。

图1 松材线虫与其他线虫USP家族系统进化树

2.2 BxUSP家族系统发育分析与保守基序

根据最大似然树最佳模型预测结果，选择WAG+G+F模型(贝叶斯信息准则(BIC)=39 051.073，赤池信息准则(AICc)=38 674.152)构建松材线虫USP家族系统发育最大似然树。通过分析松材线虫USP基因结构图(图2)，确定松材线虫USP家族基因内含子和外显子的组成情况。结果显示，19个基因中含有4～20个外显子，其中Bxusp6只有4个外显子，而Bx-usp1外显子数目多达20个。松材线虫USP家族保守基序结构分析发现(图3)，该家族具有相似的泛素特异性蛋白酶基序结构。

图2 松材线虫USP家族基因结构

图3 松材线虫USP家族保守基序结构

2.3 BxUSP家族染色体分布与结构

染色体排布结果表明，松材线虫19个Bx-usps均匀分布在松材线虫前6条染色体上。其中Bx-usp5、Bx-usp16和Bx-usp18位于第1条染色体的中部和低端；
Bx-usp1、Bx-usp2和Bx-usp3均匀分布于第2条染色体中下部；
Bx-usp4、Bx-usp6和Bx-usp17位于第3条染色体下部；
Bx-usp7和Bx-usp8位于第4条染色体上部；
Bx-usp9、Bx-usp10和Bx-usp19位于第5条染色体中上部；
其余5个基因分布于第6条染色体中部和下部(图4)，对蛋白二级结构分析表明：19个α-螺旋(23.59%～60.36%)、β-折叠(11.50%～21.32%)、β-转角(2.14%～8.07%)和无规则卷曲(23.21%～55.70%)所占比值相近(表3)。蛋白三维结构预测发现(图5)，松材线虫USP家族蛋白结构具有一定的相似性。

图4 松材线虫USP家族染色体定位

表3 松材线虫USP家族结构分析

图5 松材线虫USP蛋白三维结构预测

2.4 BxUSP家族在松材线虫不同发育阶段中的表达

通过分析松材线虫在不同发育阶段的转录组数据，获得不同发育阶段Bx-usps基因表达值，并绘制基因表达谱。结果表明，不同发育阶段Bx-usps基因表达趋势差异明显。其中Bx-usp1、Bx-usp7、Bx-usp9、Bx-usp11、Bx-usp18在线虫雌雄线虫中的表达差异明显，表明这5个Bx-usps可能主要与线虫雌雄分化相关；
Bx-usp4、Bx-usp5、Bx-usp6、Bx-usp10、Bx-usp13、Bx-usp15、Bx-usp16、Bx-usp17、Bx-usp19在线虫卵中表达量较其他时期较高，表明这7个Bx-usps可能参与松材线虫卵孵化；
Bx-usp2、Bx-usp3、Bx-usp5、Bx-usp12在2龄线虫中表达量较高，表明这4个Bx-usps可能与松材线虫的生长发育有关；
有趣的是，所有Bx-usps中只有Bx-usp14在3龄松材线虫中表达量最高，表明该家族中只有Bx-usp14参与线虫的成熟。所有Bx-usps均呈现随发育阶段增长表达量下降的整体趋势，但是Bx-usp8却表现出与其他Bx-usps相反的趋势，且Bx-usp8在抗逆态4龄线虫中表达量最高，推断Bx-usp8可能在线虫生长发育过程中表现为负反馈调节(图6和表3)。

图6 松材线虫USP基因在松材线虫不同发育阶段中的表达谱

松材线虫传入我国以来，由其引起的松材线虫病对我国的森林生态体系造成了严重破坏。研究松材线虫的生理生化机制有助于阐释松材线虫的发育规律，为防治松材线虫引发的松材线虫病提供理论依据。

本研究利用松材线虫基因组数据完成了松材线虫USP基因家族的鉴定与分析工作，共鉴定出19个松材线虫USP基因家族成员。理化性质分析表明，松材线虫USP基因家族成员的氨基酸组成在280～1 384个，分子质量在31.53～158.94 ku。系统进化分析发现，松材线虫USP基因家族成员和其他线虫USP基因家族成员之间存在一定的相似性。根据基因在染色体上的分布分析，松材线虫USP基因家族成员不均匀的分布在6条染色体上。基因结构及保守基序分析表明，各亚家族成员之间差异较大，但同一亚家族的成员间具有相似的基因结构及保守基序，说明在线虫进化过程中USP基因家族保守区域具有保留和丢失。本研究还分析了USP基因在松材线虫各发育阶段中的表达模式，推测松材线虫体内的泛素特异性蛋白酶在其生长发育过程中可能发挥着重要的作用，为后期进一步研究奠定基础。

综上所述，本研究证实了松材线虫USP基因家族成员在线虫胚胎发育、生长发育、雌雄分化过程中确实发挥着至关重要的作用，但其与松材线虫免疫过程中的作用机理仍需要进一步探索与发现。鉴于目前为止，尚无人细致描述松材线虫USP基因家族成员的促生作用，因此本研究为探索USP在松材线虫胚胎发育、生长发育、雌雄分化和防治等方面提供了新的方向与思路。