美国白蛾对摩西球囊霉定殖银中杨的适应和生理响应*

谭明涛 姜 礅 武 帅 张 杰 刘 磊 赵佳齐 孟昭军 严善春,2

(1.东北林业大学林学院 森林生态系统可持续经营教育部重点实验室 哈尔滨 150040;2.黑龙江省外来林木病虫害监测与防控重点实验室 哈尔滨 150040)

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizae fungi, AMF) 广泛存在于自然界中，属球囊菌门(Glomeromycota)，能在土壤中与植物根系形成互利共生体系。AMF可通过宿主植物获取其生长发育所需营养物质，帮助植物吸收N、P等矿质元素，并通过提高植物对N、P的利用促进植物生长(邢易梅等, 2020; Taoetal., 2016; Gaoetal., 2020; 辜晓婷等, 2020)。接种AMF的植物，其叶绿素和营养物质含量增加，应对旱、涝、病原菌侵染等不良环境的能力显著提高(Shrivastavaetal., 2015; Benhibaetal., 2015; 秦海滨等, 2014)。张蓓蓓等(2019)在干旱条件下将根内球囊霉(Glomusintraradices，GI)接种在小麦(Triticumaestivum)上，发现小麦植株籽粒的N、P含量显著增加，抗旱能力增强。董艳等(2016)研究发现，接种AMF可显著降低豌豆枯萎病的病情指数。AMF还会诱导寄主植物产生次生代谢物质，提高植物的防御能力，从而影响植食性昆虫的取食倾向、生长和繁殖(Jungetal., 2012; 何磊等, 2017)。何磊等(2017)发现甜菜夜蛾(Spodopteralitura)取食接种AMF的花生(Arachishypogaea)和番茄(Lycopersiconesculentum)后，幼虫存活率下降，幼虫历期和蛹期明显延长。Nishida等(2010)分别将GI等6种丛枝菌根真菌接种到日本百脉根(Lotusjaponicus)，发现其叶片内酚类的含量显著提高，并抑制二斑叶螨(Tetranychusurticae)的取食和产卵。昆虫为了适应寄主植物的这些不利影响，会激活体内的消化酶和解毒酶等应激机制，以维持其正常的取食和生长发育(李寿银等, 2019; 陈澄宇等, 2015)。但AMF在树木-昆虫之间的作用知之尚少。

银中杨(Populusalba×P.berolinensis)是银白杨(P.alba)与中东杨(P.berolinensis)杂交培育成的杨树新品种，具有生长快、树势壮及耐不良环境的特点(杨国日等, 2020)。美国白蛾(Hyphantriacunea)属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)，是我国危害较为严重的检疫性害虫，原产于北美洲，1979年于辽宁首次发现(Baietal., 2020)。美国白蛾食性杂，食量大，对林木、果园和农作物等造成严重危害和经济损失(Zhangetal., 2016)。为探明美国白蛾对接种AMF银中杨的生长适应及生理响应，本研究使用接种摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)的银中杨的叶片饲喂美国白蛾幼虫，观察美国白蛾幼虫的生长发育、食物的利用情况，分析其消化酶和解毒酶的活性变化，为揭示AMF在林木与植食性昆虫之间的相互作用奠定基础，并为利用AMF诱导增强林木化学防御提供理论依据。

1.1 供试银中杨幼苗及处理

2020年5月于东北林业大学苗圃，将1年生银中杨扦插苗沙埋1周，浇水保湿。将经沙埋的插穗取出后用500 mg·L-1生根粉溶液浸泡12 h后种植于规格为高230 mm、直径250 mm的花盆中。土壤基质为沙土∶草炭土∶蛭石=1∶3∶1，混合后在121 ℃下高压灭菌2 h。将花盆分为2组，处理组装入2 kg灭菌土壤与20 g GM的均匀混合物；

对照组只装入2 kg灭菌土壤。每组150株，2组共300株。GM由甘肃农科院提供，通过宿主玉米和三叶草扩繁完成，菌剂中包含孢子、菌丝、根段和沙子，其中孢子含量15个·g-1。AMF侵染率测定根据Phillips等(1970)和薛世通等(2020)方法并加以优化。在接种后90天，GM侵染率达到最高(45.6%)。

1.2 供试美国白蛾卵及试验处理

2020年8月末，从中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所昆虫病毒研发中心购买美国白蛾卵。于检疫防控实验室，将卵置于光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司HPG-280HX型)，在温度为(25±1)℃、相对湿度为(70±1)%、光周期为16 L∶8D的条件下孵化。因初孵幼虫抵抗力差，死亡率高，所以幼虫孵化后在相同条件下用人工饲料喂养至2龄后进行试验处理。将蜕皮的2龄幼虫分为2组，每组100头。接种GM 90天后，分别采摘对照组和GM组的新鲜叶片饲喂幼虫。每天更换1次叶片，直至幼虫化蛹或死亡。

1.3 美国白蛾幼虫生长发育指标测定

试验过程中，从对照组和处理组分别各随机选取30头蜕皮时间不超过24 h的3～6龄幼虫，称量体质量并记录其发育历期，用于计算3～6龄幼虫相对生长率。根据马孝龙(2019)的方法计算美国白蛾幼虫相对生长率，计算公式如下：

相对生长率(RGR)=体质量增加量/(平均体质量×取食天数)×100%。

1.4 美国白蛾幼虫食物利用指标测定

根据美国白蛾特性，低龄幼虫取食量小，生长发育缓慢，而老熟龄幼虫食量大，且寄主植物对幼虫食物利用的影响需要一定时间的积累效应，因此选取5、6龄幼虫测定其食物利用情况(潘忠玉等，2020)。从2个组再分别随机选取5、6龄幼虫各5头作为1个重复，测定取食前幼虫体质量、鲜叶质量，以及取食24 h后幼虫体质量、排粪质量和残叶质量，每组测4个重复，测后继续分组饲养；

用未饲喂幼虫的叶片测算校正失水率；

分析其食物利用情况。根据马孝龙(2019)和Yazdanfar等(2016)方法计算美国白蛾幼虫食物消耗率、转化率及利用率，计算公式如下：

取食量=(取食前鲜叶质量-取食后残叶质量)/(1-校正失水率)，食物消耗率(EAD)=(取食量-排粪质量)/取食量×100%，食物转化率(ECI)=昆虫体质量增长质量/(取食量-排粪质量)×100%，食物利用率(ECD)=昆虫体质量增长量/取食量×100%。

1.5 美国白蛾消化酶及解毒酶活性测定

从对照组和处理组各选取12头蜕皮时间不超过24 h的5、6龄幼虫，置于-40 ℃冰箱中保存，用于消化酶及解毒酶的活性测定。消化酶选取脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶进行测定；

解毒酶选取对分解外源毒物和维持昆虫正常生理代谢起重要作用的羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S转移酶(GSTs)进行测定(樊艳平等，2020；

Zhangetal., 2013)。将样品从冰箱中取出，每3头相同龄期的幼虫为1个重复(姜礅，2019)，置于玻璃匀浆器中，容器中加入3 mL预冷的生理盐水，冰浴下研磨后转入离心管。4 ℃离心，取上清液用于酶活测定。每组每龄期4个重复。各种酶活性均使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。

1.6 数据统计及分析

用Excel软件将测得的实验数据进行处理和绘图。使用SPSS22.0软件统计数据的平均值和标准误差。以LSD(最小显著法)在0.05水平下检验相同龄期处理组与对照组之间的差异显著性。

2.1 AMF定殖银中杨对美国白蛾幼虫生长发育的影响

取食GM组叶片后，美国白蛾幼虫的生长发育情况见表1、图1、2。对照组3～6龄幼虫体质量均不同程度的高于GM组，但差异不显著。GM组2～5龄幼虫发育历期显著延长(P<0.05)，6龄幼虫发育历期缩短，但与对照差异不显著。GM组3～6龄幼虫相对生长率均不同程度的低于对照(P<0.05)，其中3、5龄幼虫与对照差异显著。

表1 AMF定殖银中杨对美国白蛾龄幼虫体质量的影响①Tab.1 Effects of P. alba×P. berolinensis colonized by AMF on body weight of larvae of H. cunea

2.2 AMF定殖银中杨对美国白蛾幼虫食物利用的影响

接种GM的银中杨对美国白蛾5龄幼虫食物消耗率无显著影响，但显著抑制5龄幼虫的食物转化率和食物利用率(P<0.05)，而美国白蛾6龄幼虫的食物消耗率、转化率和利用率虽低于对照，但差异不显著(图3)。

2.3 美国白蛾幼虫消化酶活性对AMF定殖银中杨的响应

取食接种GM组叶片后，美国白蛾5、6龄幼虫的脂肪酶活性均显著提高(P<0.05)；

蛋白酶活性和淀粉酶活性呈龄期特异性，表现为5龄幼虫均略高于对照，但差异均不显著；

6龄幼虫均显著高于对照(P<0.05)(图4)。

图1 AMF定殖银中杨对美国白蛾龄幼虫发育历期的影响Fig. 1 Effects of P. alba×P. berolinensis colonized by AMF on developmental duration of larvae of Hyphantria cunea*同一龄期不同处理之间差异显著 (P<0.05)，下同。The asterisk indicated that there were significant differences among different treatments at the same instar (P < 0.05), the same below.

图2 饲喂GM组叶片对美国白蛾幼虫相对生长率的影响Fig. 2 Effects of feeding GM leaves on the relative growth rate of larvae of H. cunea

图3 饲喂GM组叶片对美国白蛾幼虫食物消耗率、转化率和利用率的影响Fig. 3 Effects of feeding GM group leaves on food digestion rate, food conversion rate and food utilization rate of larvae of H. cunea

图4 饲喂GM组叶片对美国白蛾幼虫消化酶活性的影响Fig. 4 Effects of feeding GM group leaves on digestive enzymes activities of larvae of H. cunea

2.4 美国白蛾幼虫解毒酶活性对AMF定殖银中杨的响应

GM组CarE活性，5龄幼虫略高于对照但差异不显著，6龄幼虫显著提高(P<0.05)；

GSTs活性，在5龄时被显著抑制，6龄时被显著激发(P<0.05)。

图5 饲喂GM组叶片对美国白蛾幼虫解毒酶活性的影响Fig. 5 Effects of feeding GM leaves on detoxification enzymes activities of larvae of H. cunea

本研究表明，外源接种GM的银中杨对美国白蛾幼虫的生长发育和食物利用均有不同程度抑制作用。笔者前期研究发现，接种GM的银中杨体内的总酚、黄酮、木质素、单宁等次生代谢物质，以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)和胰蛋白酶抑制剂(TI)等防御蛋白活性显著增加，这可能是GM组初期对美国白蛾幼虫生长发育和食物利用的表现为抑制作用的原因。Murrell等(2020)发现玉米的防御能力随着AMF定殖量增加而增强，欧洲玉米螟发育速率随玉米防御能力增强而降低。Selvaraj等(2020)研究发现，接种GI能提高黑吉豆(Vignamungo)叶片中酚类、木质素等防御代谢产物含量及防御蛋白活性，显著降低斜纹夜蛾(Spodopteralitura)的取食效率。同时，本研究发现，GM组美国白蛾3～5龄幼虫的体质量虽与对照无显著差异，但其发育历期显著延长，导致其相对生长速率降低。说明GM处理能降低美国白蛾的发育速率，延长其暴露于不良环境的时间，增加被天敌捕食的风险。而GM组6龄幼虫的体质量和发育历期均与对照无显著差异，表明美国白蛾具有较强的抗逆响应能力，在生长发育过程中能逐渐适应不良寄主植物，这从一个侧面反映了美国白蛾能够经常性暴发成灾的机理。

消化酶是由昆虫消化系统分泌的一类水解酶，包括脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，能将食物中包含的营养成份分解成可被吸收和利用的小分子物质，为昆虫的生长发育提供所需的营养和能量(Baghbanetal., 2014; 李艺琼等, 2017)。本研究发现，取食GM组叶片后，美国白蛾5龄幼虫对食物的利用受到显著抑制，仅脂肪酶活性被显著激发，其原因可能是美国白蛾幼虫取食GM定殖银中杨叶片后的自我生理调节(鲁智慧等, 2020; 向玉勇等, 2020)；

而6龄幼虫3种消化酶活性均显著增加，对食物的利用没有受到显著抑制。表明随着处理时间延长，美国白蛾幼虫会激活消化系统，适应寄主质量的变化。消化酶活性的变化反映出美国白蛾对消化系统的调节能力和对寄主植物的适应能力。

解毒酶是一种以协助昆虫直接溶解或消化外源毒物为目的的防御酶，谷胱甘肽-S-转移酶和羧酸酯酶作为昆虫体内重要的解毒酶，其活性能够被多种次生物质诱导，以增强对次生物质的代谢能力，提高对寄主的适应性并维持自身正常的生长发育(陈锐等, 2020; 黄敏燕等, 2018)。本研究中，美国白蛾5龄幼虫的GSTs活性显著低于对照，CarE活性与对照相近，而美国白蛾6龄幼虫的GSTs与CarE活性均显著高于对照，说明美国白蛾幼虫能够通过提高解毒能力去响应寄主植物质量的变化，逐渐抵御和适应不良寄主植物造成的毒害。姜礅等(2017)研究发现，茉莉酸甲酯能诱导增强长白落叶的化学防御，落叶松毛虫取食后，其体内解毒酶活性的响应趋势表现为4龄时均显著低于CK，5龄时不同程度地高于CK。潘忠玉等(2020)发现使用高浓度绿原酸处理后，美国白蛾幼虫肠道中的GSTs等解毒酶的活性显著提高，说明美国白蛾幼虫可能通过诱导其解毒酶活性从而对食物中的绿原酸产生适应性。美国白蛾解毒酶活性的显著提高，再次反映出其拥有极强的抗逆响应能力。

解毒酶与消化酶一起构成了美国白蛾应对不同质量寄主植物的重要防线。Chen等(2020)发现美国白蛾营养代谢和解毒相关基因在寄主选择和适应时显著表达，说明这些基因参与调控美国白蛾适应寄主植物。Wu等(2019)发现在美国白蛾基因组中，与碳水化合物代谢和味觉受体相关的基因和途径大量扩增，并在入侵种群中显示出功能多态性，揭示了美国白蛾作为外来物种的入侵性和适应性强的分子机制。因此，在基因调控下激活由解毒酶和消化酶组成的抵御机制可能是美国白蛾经常暴发并难以防治的重要原因之一。

GM定殖银中杨能够影响美国白蛾幼虫的生长发育和食物利用能力，说明AM真菌可被作为化学类药剂的潜在替代品，应用于农林业生产过程中害虫的防治。然而，美国白蛾幼虫会激活其消化及解毒机制来适应和响应AMF定殖后寄主植物质量的恶化，以维持其正常的生长发育。