补肾复方在绝经后骨质疏松症动物模型中的研究进展*

尹 航，董 博，康武林，袁普卫，刘德玉

（1.陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712046；
2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

骨质疏松症（osteoporosisi，OP）是一类以单位骨量减少、骨微结构破坏为特征，导致骨的脆性增加、易于发生骨折的全身性代谢骨病[1]。绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是绝经后女性卵巢功能减退，体内雌激素水平下降，成骨细胞活性减弱，破骨细胞活性加强，骨吸收大于骨形成，使骨代谢呈现高转换型而形成的代谢性骨骼疾病[2]。现代医学主要使用抗吸收药、合成代谢药及骨矿化药等药物抑制破骨过程、维持骨结构、延缓疾病进展，但其存在不良反应较大、患者耐受度低、安全性和有效性尚不理想等不足。补肾复方治疗本病疗效确切，副作用小，患者接受程度高，应用前景广阔。现总结补肾复方在绝经后骨质疏松症动物模型中的实验研究进展，为补肾复方的临床应用推广提供参考。

中医学认为，PMOP归属“骨痿”“骨极”“骨枯”等范畴。《素问·痿论篇》中记载：“五藏使人痿……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”本病与肾关系密切，肾精充足，则骨髓化生有源，筋骨劲强，关节滑利；
肾精不足，则骨髓化生无源，腰脊不举，骨枯而痿。《灵枢·决气》记载：“谷入气满，淖泽注于骨，骨属屈伸，泄泽，补宜脑髓，皮肤润泽。”后天脾胃的功能与骨骼的正常生长密切相关，脾气健旺得以维持骨的正常功能。《灵枢·本脏》中记载：“是故血和则经脉流行，营复阴阳，筋骨劲强，关节清利矣。”气血充盈与骨骼强健紧密相关，气血充盈则筋骨强。由此可见，本病属本虚标实之证，以肾虚、脾虚为本，血瘀为标，对于本病的治疗多以补肾为主，兼以强筋壮骨、健脾养血、活血祛痰。临床上应用的补肾复方制剂如二仙汤[3]、更年骨坚方[4]、六味地黄丸[5]及补肾药膳[6]等治疗效果显著，对骨生长、骨密度及疼痛症状等均有一定的改善。

绝经后骨质疏松症动物模型是动物体内雌激素水平下降，导致骨吸收增强、骨丢失过多而引起的骨质疏松症。目前造模常用的实验动物有大鼠、小鼠、兔、羊及非人类灵长类动物等，在实验动物选择中常以雌激素缺乏导致的骨质疏松动物模型作为首选。由于大鼠具有成本低廉、易于饲养、短时间内可达到新的骨改建动态平衡、骨代谢特点与绝经后女性骨质疏松相似、模型稳定及实验结果可信度高等特点，故大鼠目前被广泛应用于PMOP的研究[7-8]。目前PMOP动物模型常用造模法大体可分为两类：手术去势法和药物去势法。而手术去势法中的雌性动物双侧卵巢切除是PMOP最常用的造模方法[9]。

2.1 手术去势法 手术去势法是指利用外科手术方法将动物生殖系统切除，使其功能丧失以达到动物模型建立的方法。1969年SAVILLE P D.[10]首次通过外科手术切除雌性大鼠卵巢成功建立了PMOP模型。邱宇等[11]通过研究去卵巢小鼠术后不同时期骨微结构的动态变化，证实去卵巢法可成功制备出PMOP模型，且发现小鼠在去卵巢术后1周至1个月松质骨微结构明显受损，早于皮质骨骨化。

2.2 药物去势法 药物去势法是在不切除动物生殖系统的情况下，通过给予动物抑制雌激素分泌的药物从而模拟绝经后状态，使体内雌激素水平降低，达到骨量丢失等骨质疏松症状的造模方法。目前常用的药物有促黄体激素释放激素受体激动剂、雌激素受体拮抗剂、非甾体类雄激素拮抗剂等。此造模法具有无创伤、不产生干扰检测的电解质紊乱及不激发动物手术应激反应等优点，但由于各类药物的副作用，实验结果可信度不高，相较于手术去势法其应用范围明显受限。

虽然绝经后骨质疏松症动物造模方法有很多，而手术去势法造模具有造模率高、稳定性好、造模周期短的特点，因此成为PMOP的经典造模方法。

3.1 免疫调节作用 T细胞是重要的免疫调节细胞，同时也是骨吸收的重要调节因子。最新发现的两种T细胞亚群即辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）与调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）在维持成骨与破骨细胞的平衡中发挥了重要的作用。PMOP患者体内雌激素水平下降，使免疫系统“辅助手”（cluster of differentiation 4+，CD4+）T细胞产生更多的Th17，从而出现Th17偏移。Th17产生的炎症因子白细胞介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）可诱导破骨细胞形成，从而引起骨量丢失[12]。Treg可产生白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）炎症抑制因子，可抑制Th17效应因子，从而起到抑制骨吸收的作用[13]。刘金勇等[14]研究发现龟鹿补骨方可降低去卵巢大鼠血清中白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，而升高IL-10水平，表明龟鹿补骨方可调节Th17、Treg及相关因子的表达，逆转Th17/Treg失衡状况，防治PMOP。

3.2 对激素或细胞因子的调节作用 多种细胞因子在PMOP疾病发生发展过程中起着重要的作用。血清生长激素（growth hormone，GH）和胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）是调节骨平衡的重要因素，主要表现为维持骨量。苏海容等[15]通过给去卵巢大鼠灌胃补肾壮骨颗粒，发现补肾壮骨颗粒可提高去卵巢骨质疏松症大鼠血清GH和IGF-1水平，在防止骨量丢失的同时增加骨密度。IL-17和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是PMOP疾病进展中的重要促炎因子。刘立萍等[16]通过观察补肾填精方左归丸对PMOP模型大鼠炎症因子的影响，发现补肾填精方可明显降低大鼠血清IL-17、TNF-α水平，从而有效防治PMOP。

3.3 抑制骨吸收和促进骨形成作用 PMOP主要表现为骨量减少和骨微结构破坏，骨代谢的平衡取决于骨形成和骨吸收之间的动态平衡。当骨吸收大于骨形成时，导致骨微结构紊乱的因素均会促进骨质疏松症的发生。细胞核因子κΒ受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κΒ ligand，RANKL）是维持破骨细胞功能和促使其分化成熟的重要因子，可促进破骨细胞的分化，增强破骨细胞的活力，而骨保护素（osteoprotegerin，OPG）蛋白能抑制破骨细胞的功能。闵文等[17]研究发现补肾通络方通过降低RANKL/OPG蛋白表达可抑制破骨细胞功能，抑制骨吸收。过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子-1α（asubunit of peroxisome proliferatorsactivated receptor-γcoactivator-1，PGC-1α）和类固醇受体辅助激活因子3（steroid receptor coactivator-3，SRC-3）均可通过活化相应的核受体参与雌激素调节的骨代谢过程。研究表明，补肾壮骨颗粒可能通过提高去势大鼠血清及骨髓组织中SRC-3和PGC-1α分子及基因表达水平，以促进骨形成，提高骨密度[18]。郑志坚等[19]通过构建体内去卵巢小鼠OP模型和体外骨疏康颗粒含药血清诱导破骨细胞分化和凋亡模型，明确了骨疏康颗粒防治PMOP是通过诱导体内外破骨细胞凋亡，抑制破骨细胞的骨吸收，从而减少骨量丢失实现的。转录激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）可通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能，实现对骨骼生长发育的调控。邓洋洋等[20]研究表明补肾活血方可上调大鼠肾组织中ATF4蛋白表达，下调大鼠骨组织中ATF4蛋白表达，以促进成骨细胞增殖分化和抑制破骨细胞增殖分化。股骨骨矿含量（bone mineral content，BMC）是判断骨质疏松中骨量丢失的重要指标。安方玉等[21]研究表明温肾强身散可提高大鼠股骨组织中BMC的水平，进而抑制骨组织的吸收，促进骨组织的形成。成骨细胞特异性转录因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、成骨细胞特异基因（osteoblast specific gene，Osterix）是成骨细胞分化和成熟的重要特异性转录因子，可促进骨形成。王剑等[22]研究发现鹿茸中药复方可下调去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Runx2、Osterix启动子甲基化水平，促进其转录和表达，从而促进成骨细胞分化，有效防治PMOP。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）参与了骨基质的钙化和重吸收。骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）与骨代谢关系密切。受体整合素ɑvβ3（receptor integrin ɑvβ3，Itgɑvβ3）可与OPN和BSP相互作用，调控骨吸收功能。研究表明青娥方可使卵巢切除大鼠骨组织OPN、BSP和Itgɑvβ3表达下降，抑制破骨细胞功能活性，减少骨质丢失[23]。

3.4 对骨代谢的调节作用 骨组织是由破骨细胞吸收旧骨和成骨细胞形成新骨以完成骨转化的活组织。在骨转化过程中，钙磷代谢调节指标、激素与细胞因子、骨吸收标志物和骨形成标志物等骨代谢生化指标发挥着重要的调节作用[24]。上述骨代谢指标主要包括碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，BGP）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（aminoterminal propeptide of typeⅠprocollagen，PINP）、Ⅰ型前胶原羧基端前肽（carboxyterminal crosslinked propeptide of typeⅠprocollagen，PICP）和Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（crosslinked carboxyterminal peptide of typeⅠcollagen，ICTP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP）、β胶原降解产物（β-Crosslaps，β-CTX）等。ALP为特异性的骨形成标志物，可反映成骨细胞的活动。TRACP是骨质疏松症筛查的敏感指标，同时也是高特异性的骨吸收标志物。PINP、PICP和ICTP是反映胶原代谢的生化指标，其中PINP和PICP反映骨形成，ICTP反映骨吸收。β-CTX是反映骨吸收的特异性敏感指标。BGP由成骨细胞分泌产生，是骨重建的标志物。尿中脱氧吡啶啉（deoxypryidinoline，D-Pyd）是骨和软骨胶原的特异性指标，是反映骨吸收的重要指标之一。左归丸可明显降低去卵巢大鼠尿中D-Pyd含量，提高血清中BGP含量，以促进骨形成和抑制骨吸收，发挥抗骨质疏松症作用[25]。杨骏杰等[26]研究发现骨疏康颗粒可降低β-CTX的表达，同时提高PINP、BGP、ALP的表达，以延缓骨量丢失。也有研究[27]发现地黄饮子水煎剂可通过提高大鼠血清BGP含量，降低血清TRACP含量，维持骨代谢的动态平衡，发挥抗骨质疏松的作用。刘立萍等[28]研究表明补肾填精方左归丸可通过降低去卵巢大鼠血清PICP和ICTP含量，干预Ⅰ型胶原的合成与分解，从而防治PMOP。

3.5 对信号通路的调节作用

3.5.1 对Wnt/β-catenin信号通路的影响 经典Wnt（Wingless）/β连环蛋白（β-catenin）信号通路在成骨细胞分化和骨形成过程中扮演着重要角色。Wnt蛋白家族由19个分泌型糖蛋白组成，其中Wnt3a（Wingless 3a）可通过Wnt通路促进成骨细胞的增殖和分化，同时抑制破骨细胞的表达，Wnt7b（Wingless 7b）可显著增加成骨细胞的数量及活力，抑制破骨细胞的表达[29]。在Wnt信号通路被激活时，β-catenin与核内转录因子结合启动靶基因转录，以促进成骨细胞的分化增殖[30]。邢威等[31]研究发现杜仲健骨方可提高大鼠骨组织中Wnt3a和β-catenin的mRNA及蛋白表达水平，表明杜仲健骨方可通过调节Wnt/βcatenin信号通路，发挥治疗OP的作用。王庆谚等[32]研究发现补肾益气活血方可上调Wnt7b、Axis抑制蛋白2（recombinant axis inhibition protein 2，Axin2）、Runx2的mRNA及蛋白表达，即补肾益气活血方可通过调节Wnt7b/β-catenin信号通路的相关因子，促进成骨分化，从而防治PMOP。

3.5.2 对OPG/RANKL/RANK信号通路的影响 OPG/RANKL/核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factorκΒ，RANK）信号通路是调节骨吸收和骨形成平衡的重要信号轴，与PMOP有密切联系。RANK可与RANKL结合使前体细胞内信号开始传导，以促进破骨细胞（osteoclast，OC）的增殖分化，而OPG可竞争性结合RANKL，抑制OC的活化和骨吸收[33]。姜宜妮等[34]发现二至丸可通过调节PMOP模型大鼠的OPG/RANKL和RANK/RANKL表达水平，抑制OC活性，促进成骨细胞（osteoblast，OB）形成，从而改善骨质疏松。颜春鲁等[35]研究发现地黄饮子水煎剂可使PMOP模型大鼠OPG含量升高，而RANKL和RANK含量降低，表明地黄饮子水煎剂可通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路抑制骨吸收和促进骨形成，从而发挥抗骨质疏松作用。

3.5.3 对BMP2/Smad/RUNX2信号通路的影响 骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/细胞信号传导蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad）/RUNX2信号通路是参与成骨细胞分化及促进骨形成的重要通路。BMP2可诱导OB分化和促进骨形成，Smad可与RUNX2相互作用参与OB基因的分化及表达[36]。而胎球蛋白A（recombinant human fetuin A，Fetuin-A）和基质gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）是BMP2/Smad/RUNX2信号通路中重要的调节因子。相关研究发现PMOP患者血清Fetuin-A水平的降低和MGP在骨组织局部的聚集是疾病发生的重要原因之一[37]。张麟等[38]发现补肾化痰方可通过提高PMOP大鼠血清Fetuin-A含量和降低骨组织局部MGP含量，进而调节BMP2/Smad/RUNX2信号通路实现抗骨质疏松的作用。周亚娜等[39]通过研究发现补肾化痰方也可通过提高血清及骨组织中BMP2和RUNX2含量，影响BMP2/Smad/RUNX2信号通路，起到促进骨形成的作用。

3.5.4 对其他信号通路的影响 除以上通路外，补肾复方还可通过调节其他多种信号通路发挥抗骨质疏松的作用。如金匮肾气丸可促进成骨细胞内雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）表达，抑制磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated adenylate activated protein kinase，p-AMPK）蛋白表达，促进OB增殖分化，改善OB功能[40]。补肾活血方可通过调节骨内谷氨酸的表达，介导骨重建，改善骨质疏松症状[41]。补肾、活血中药复方（左归丸、身痛逐瘀汤）可提高indian hedgehog（IHH）mRNA及蛋白表达，以激活IHH信号通路发挥防治骨质疏松作用[42]。补肾化痰方可通过降低血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）及骨组织Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的mRNA和蛋白表达水平，抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路，从而改善骨量丢失[43]。

绝经后骨质疏松症已成为绝经后女性最常见的代谢性骨病，西医治疗本病局限性较多，而补肾复方治疗本病疗效确切。虽然补肾复方在动物模型中的相关研究对于指导临床工作具有一定价值，但由于补肾复方中药物的复杂性，其具体的作用机制及途径尚不完全明确，且缺少补肾复方中单味中药对于动物模型的研究，今后应加强复方的具体作用机制及单味中药的研究，以更好地指导临床工作。