饲粮中添加迷迭香提取物对吉富罗非鱼生长性能、血清脂质代谢和肝脏抗氧化功能的影响

■孙大淇 徐树德 郑 欣 胡海波 胡 毅

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；
2.广东植之源生物科技有限公司，广东广州 510000；
3.中国海洋大学，农业农村部水产动物营养与饲料重点实验室，教育部海水养殖重点实验室，山东青岛 266003；
4.湖南植之源农牧有限公司，湖南长沙 410007）

迷迭香（Rosmarinus officinalisL.）是一种多年生芳香植物，属于双子叶植物纲、唇形科，在曹魏时期被引种至我国，当前已在贵州、云南、湖南和广西等地广泛种植。诸多研究表明：迷迭香连同其提取物包括鼠尾草酸、迷迭香酸、熊果酸、齐墩果酸等，拥有多种生物学功能，如抗肿瘤、抗炎症及抗氧化、抑菌、改进血脂代谢水平、保肝护肝等[1-4]，是具有广阔市场前景的绿色、安全的替抗产品。

目前，已有不少关于迷迭香提取物在畜牧生产中应用的研究，如提高肉鸡的生长性能、改善肉品质[5-6]和抗氧化能力[7]、提高蛋鸡的产蛋率[8]、提高奶山羊的抗氧化和免疫能力[9]。关于迷迭香提取物在水产上的研究已有部分报道，如添加迷迭香提取物可以提高虹鳟（Oncorhynchus mykiss）生长，改善血脂代谢水平，增加肠道中消化酶和血清中抗氧化物酶活力，如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶[10]、金头鲷（Sparus aurata）饲粮中添加迷迭香提取物够降低肝脏脂肪变性率和血清转氨酶的水平[11]、在大西洋鲑鱼（Salmo salar）饲粮中添加含迷迭香的功能性饲料能够调控免疫相关基因的表达，提高其抗氧化状态，增强机体的抗应激能力[12]，然而，迷迭香提取物的添加对黑鲈（Dicentrarchus labrax）的生长无显著性影响[13]。综上，迷迭香提取物在水产上的研究主要集中在一些名贵品种上，在一些地方特色品种上的报道鲜有。吉富罗非鱼（genetic improvement of farmed tilapia, GIFT,Oreochromis niloticus）可归类于遗传性状改良后的尼罗罗非鱼，具有诸多优点，如高的生长速率和出肉率、稳定的遗传形状等，是两广地区、海南等温暖地区的特色养殖品类[14]。因此，本试验以吉富罗非鱼为研究对象，添加不同水平的迷迭香提取物到吉富罗非鱼饲粮中，研究其对吉富罗非鱼生长、血清脂质代谢和肝脏抗氧化功能的影响，以期为迷迭香提取物在吉富罗非鱼的健康养殖中提供应用依据。

1.1 试验材料

健康的吉富罗非鱼由广东省珠海市的百容鱼苗厂提供。试验用迷迭香提取物由湖南植之源农牧有限公司提供，其中齐墩果酸含量为0.5%、熊果酸含量为1.5%。

1.2 试验设计

吉富罗非鱼540 尾，随机地分成6 个处理组（3 重复/组，30尾鱼/重复），其中处理1组饲喂基础饲粮，处理2～6 组饲喂添加了迷迭香提取物的日粮。迷迭香提取物在5 个处理组中的添加浓度分别为0.01%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%。基础饲料组成及营养水平如表1。

表1 基础饲料组成及营养水平（风干基础，%）

1.3 饲养管理

广东溢多利生物科技股份有限公司为本研究提供了试验鱼的养殖场所。吉富罗非鱼从百容鱼苗场购买，运回养殖基地后，用基础饲料暂养驯化2周，之后，按照试验设计进行分组投喂。养殖试验持续60 d，饲养期间，每天定点（09：00和15：00）定量投喂。根据吉富罗非鱼重量的2%～4%确定投喂量，并根据养殖期间吉富罗非鱼的饲料消耗、生长速度以及水温情况等适当调整。养殖期间，水温25.2～29.8 ℃，pH 7.2～7.8，亚硝酸盐浓度＜0.1 mg/L，氨氮浓度＜0.3 mg/L，溶解氧＞6.0 mg/L。试验期间，每天观察吉富罗非鱼的游动情况和健康状况，按期排污和换水，并对管理进行记录。

1.4 样品采集

持续60 d 的养殖试验结束后，所有试验鱼饥饿24 h后进行采样。首先，对每个处理组的试验鱼进行计数和称重。随后，每个处理组随机选择6 尾体重均匀的鱼，用麻醉剂说明书上的推荐剂量进行麻醉，尾静脉取血，采集后立即在冷冻离心机下离心10 min（4 000 r/min），收集的上清液储存于超低温冰箱中（-80 ℃），后续用于测定血清相关指标。最后，解剖取完血的试验鱼，取出肝脏，液氮速冻后保存于超低温冰箱中（-80 ℃），后续用于测定肝脏抗氧化相关指标。

1.5 测定指标和方法

1.5.1 生长性能相关指标的计算公式增重率（WGR，%）=增重（g/尾）/初重（g/尾）×100特定生长率（SGR，%/d）=（lnWt-lnWo）×100/t

式中：Wt、Wo——分别代表试验鱼末重和初重（g/尾）；

t——试验天数（60 d）。

饲料系数（FC，%）=采食量（g/尾）/增重（g/尾）

肥满度（CF，g/cm3）=鱼体重（g/尾）/[体长（cm）]3×100

脏体比（VSI，%）=鱼内脏重（g/尾）/鱼体重（g/尾）×100

肝体比（HSI，%）=鱼肝脏重（g/尾）/鱼体重（g/尾）×100

1.5.2 血清相关指标测定方法

南京建成生物工程研究所有限公司提供相关试剂盒，分别采用COD-PAP法和GPO-PAP法在510 nm波长下检测总胆固醇（total cholesterol, TC）与三酰甘油（triglyceride, TG）水平，采用赖氏法在505 nm 波长下检测谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）与谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）水平，采用双试剂法检测低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）与高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）水平。

1.5.3 肝脏抗氧化指标的测定方法

南京建成生物工程研究所有限公司公司提供相关试剂盒，采用紫外比色法在340 nm 波长下检测谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR），采用羟胺法在550 nm 波长下检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD），采用比色法在412 nm波长下检测谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）与谷胱甘肽硫转移酶（glutathione-S-transferase，GST），采用钼酸铵法在405 nm 波长下检测过氧化氢酶（catalase, CAT），采用硫代巴比妥酸法在532 nm波长下检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）。

1.6 统计与分析

所有试验结果采用“平均数±标准差（measns ±SD）”表示，SPSS 20.0软件，用于对结果进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并结合Duncan’s 法对数据进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著水平。

由表2可知，各处理组间肥满度的数值结果未有显著性差异（P＞0.05）。吉富罗非鱼的末重、特定生长率和增重率的值，随饲粮中添加的迷迭香提取物的水平的上升而增加，当迷迭香提取物的添加水平达到0.05%时，这些参数的值与对照组有显著性差异（P＜0.05），且添加水平达到0.20%时达到最大值。吉富罗非鱼的饲料系数、肝体比和脏体比随着饲粮中迷迭香提取物添加水平的增加而下降，当迷迭香提取物添加水平分别达到0.10%、0.10%和0.15%时，这些参数的值达到最小。

表2 迷迭香提取物对吉富罗非鱼生长性能的影响

由表3 可知，血清中，各组间高密度脂蛋白胆固醇的值无显著性改变（P＞0.05），而三酰甘油、总胆固醇、谷草转氨酶、低密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶的值，随饲粮中迷迭香提取物添加水平的增加呈下降趋势，当添加水平为0.01%时，均达到与对照组差异显著（P＜0.05）；
当添加量水平分别为0.20%、0.10%、0.20%、0.15%、0.20%，这些参数的值达到最小。

表3 迷迭香提取物对吉富罗非鱼血清生化指标的影响

由表4可知，各组间谷胱甘肽还原酶的值无显著性变化（P＞0.05）。肝脏中，丙二醛含量，随着饲粮中迷迭香提取物添加水平的上升而减少，当添加水平达到0.15%时，达到最小（P＜0.05），随后趋于稳定。肝脏中，其他抗氧化指标，如过氧化氢酶、谷胱甘肽硫转移酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶，这些参数的值，随着饲粮中迷迭香提取物添加水平的上升而增高，当迷迭香提取物添加水平为0.01%时，均与对照组差异显著（P＞0.05），随后趋于稳定；
当添加量分别达到0.20%、0.20%、0.05%、0.20%达到最大值。

表4 迷迭香提取物对吉富罗非鱼肝脏抗氧化指标的影响

3.1 迷迭香提取物对吉富罗非鱼生长性能的影响

植物提取物中的主要活性成分有：挥发油、黄酮、多糖、多酚、皂苷、生物碱、三萜类化合物、有机酸等，这些成分的化学结构常包含酚、醚、酮、萜等功能性基团[15]。迷迭香是一种芳香植物，而熊果酸和齐墩果酸是采用醇提技术，从迷迭香中提取的五环三萜类化合物，两者属于同分异构体，具有相似的生理功能[16]。抗肿瘤、抗炎及抗氧化、抑菌、改进血脂代谢水平、保肝护肝等这些有益作用均可在迷迭香及其提取物中发现[1-4]。Yagoubi等[17]在羔羊上的试验显示，迷迭香蒸馏渣的添加可以提高羔羊的平均日增重和功能性器官（皮肤、肝脏、肾脏和睾丸）的重量。在肉鸡上的研究显示，迷迭香精油的添加可以上调肉仔鸡的日增重、下调料重比[5]。但在金头鲷[11]和黑鲈[13]上的研究显示，饲粮中迷迭香提取物的添加对其生长性能、体组成等无显著影响。本试验结果显示，迷迭香提取物的添加，上调了吉富罗非鱼的特定生长率、增重率，下调了饲料效率、脏体比和肝体比，表明饲粮中迷迭香提取物的添加能够提高吉富罗非鱼的生长性能、改善形体指标。本试验的结果与如上部分研究的结果不一致，可能是因为植物提取工艺的差异会导致活性产物的成分和浓度不一致；
不同动物品种、不同的饲粮配方组成、不同的饲养环境均会对试验结果有一定影响。

3.2 迷迭香提取物对吉富罗非鱼脂质代谢的影响

付志欢等[18]的研究报道：血清中三酰甘油、总胆固醇、低/高密度脂蛋白胆固醇水平的变化反映了机体脂质的水平。血清中较低的三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇浓度反映出肝脏中脂肪的分解代谢较高[19]。本试验结果显示，饲粮中添加迷迭香提取物能够降低吉富罗非鱼血清三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇的含量。表明迷迭香提取物的添加能够促进吉富罗非鱼体内脂质的分解代谢。这与Hernandez 等[11]在金头鲷上的结果一致，饲粮中迷迭香提取物的添加能够降低血清中三酰甘油和总胆固醇的含量。谷草转氨酶和谷丙转氨酶属于转氨酶类，在动物机体代谢氨基酸的过程中发挥紧要作用[20]。正常情况下，谷草转氨酶和谷丙转氨酶，两者主要存在于肝脏中，当检测到血液中有较高的浓度时，表明肝细胞已经受损[21]。研究报道，齐墩果酸和熊果酸是迷迭香提取物中活性成分，两者均具有保肝护肝的功效，其中，齐墩果酸在四氯化碳引起的肝细胞坏死、脂肪疏松及变性、线粒体肿胀、间质炎症反应及肝糖原减少等过程中有明显的缓解作用[22-23]，熊果酸在乙醇诱导离体的大鼠肝细胞受损、释放转氨酶等过程中具有明显的保护作用[24]。本研究中得到的数据显示：与对照组比，迷迭香提取物的添加可以下调吉富罗非鱼血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量。表明迷迭香提取物的添加能够提高吉富罗非鱼的脂质代谢水平，进而起到保肝护肝的效果，最终达到促进健康生长的作用。这些有益作用的实现可能与熊果酸和齐墩果酸抗脂质氧化和清除氧自由基的作用有关，具体的作用机制需深入研究。

3.3 迷迭香提取物对吉富罗非鱼肝脏抗氧化功能的影响

机体内脂质类物质易发生氧化，继而受损，产生丙二醛，其含量的升降可用来衡量受损程度[25]。动物为了抵抗氧化损伤，其机体自身有一套抗氧化系统，主要是一些抗氧化酶和非酶性物质，前者主要包含超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽硫转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶等[26]。在大鼠上的研究发现：灌服熊果酸可以改善慢性乙醇性肝脏组织病理学损伤、提高谷胱甘肽、VC和VE的水平，降低血清过氧化脂质水平[27]。在小鼠上的研究发现：灌服齐墩果酸可降低乙醇引起的肝组织中丙二醛的含量和提高过氧化氢酶活性[28]。任骏等[29]的研究报道：熊果酸和齐墩果酸，可以缓解四氯化碳、阿霉素等外源刺激引起的脂质过氧化反应。沈根明等[30]的研究报道，迷迭香提取物的添加，可以降低蛋鸡血清中丙二醛含量、增加超氧化物歧化酶活力。同样，在水产动物上的研究发现：添加迷迭香提取物至饲料中，可以上调鲤鱼血清抗氧化酶活力（如过氧化氢酶和超氧化物歧化）[31]、提高虹鳟血清中抗氧化酶活力（如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，不包括过氧化氢酶）[32]。本试验结果显示：添加迷迭香提取物至吉富罗非鱼饲料中，可以增加血清中抗氧化酶活力（包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶），下调丙二醛的含量。如上结果说明，迷迭香提取物的添加可以提升吉富罗非鱼的抗氧化能力。其原因可能是：①齐墩果酸和熊果酸的分子结构含有羟基且支链包含碳碳双链，具有明显的还原性，可以有效分解动物机体因氧化应激产生的氧化产物，并提高抗氧化酶活力[33]；
②熊果酸和齐墩果酸可以直接清除超氧阴离子，并抑制黄嘌呤氧化酶的活力[34]，清除DPPH自由基[35]，降低自由基对机体的损伤；
③熊果酸可以通过激活细胞中的核转录因子-κB（NF-κB），进而增强细胞的屏障功能和抵御应激的能力[36]。

迷迭香提取物添加至吉富罗非鱼饲粮中，可以增加其体增重，降低饲料系数、肝体比和脏体比。同时，迷迭提取物能够改善吉富罗非鱼脂质代谢状况，增强肝脏抗氧化能力，最终促进吉富罗非鱼的健康生长。综合性价比建议，吉富罗非鱼饲料中适宜的迷迭香提取物添加水平为0.05%。