五味子提取物对咳嗽变异性哮喘大鼠气道重塑的影响及作用机制

胡朋 林捷 王锋 符燕 符琼方 吴易晟

(1海口市人民医院中医科，海南 海口 570208;2湖北省中医院急诊科;3海南省中医院肺病科)

咳嗽变异性哮喘临床主要症状表现为慢性持续性干咳，多以夜间咳嗽增多为主〔1〕。有研究显示〔2〕，限制并抑制炎症反应后可改善疾病的临床症状，咳嗽变异性哮喘类似于典型的哮喘发病机制，主要与气管炎症、致敏、气道重塑密切相关。五味子具有益气生津及安心之功效，临床中常用于治疗久咳虚喘等〔3〕，有学者在研究中指出〔4〕，五味子具有调节细胞免疫功能，对机体非特异性免疫功能及特异性体液免疫功能中具有调理作用。本研究旨在分析五味子提取物对咳嗽变异性哮喘模型大鼠气道重塑的影响及作用机制。

1.1研究动物 选取75只大鼠，由郑州大学实验动物中心提供(动物许可证号：SYXK(豫)2021-0009)，鼠龄3～5个月，平均(3.80±0.95)个月，体重213～256 g，平均(230.80±19.15)g，将大鼠放置室温23～25℃，湿度40%～70%，自然光照、通风的无病原菌干净笼子中饲养，饮用的水和食物均经消毒。

1.2建模 在75只大鼠中随机选取15只作为正常组不做任何处理，其余大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各15只，参照楚慧伦等〔5〕研究实验中咳嗽变异性哮喘建立方法建立大鼠模型，除正常组外，其余4组均在喂养10 d后将其置于密闭有机玻璃罩内，给予含有1%配制卵清白蛋白(OVA)溶液的生理盐水进行超声雾化激发2 min，1次/d，共10 d。模型建立成功标准：大鼠出现竖毛、喷嚏、干呕、极度烦躁等现象中两种或两种以上判定为造膜成功。

1.3给药 在五味子中提取五味子，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别给予五味子灌胃5 w，剂量分别为低剂量组(1.0 ml五味子提取物)、中剂量组(1.5 ml五味子提取物)、高剂量组(2.5 ml五味子提取物)，正常组和模型组给予等体积生理盐水进行注射。

1.4病理组织学观察 在大鼠灌胃后、禁食不禁水12 h，麻醉处死，观察其气道重塑程度，迅速摘取右侧肺下叶组织后立即固定在染色液中，将所制备的大鼠右侧肺下叶组织样本在甲醛溶液中固定24 h后，行常规脱水、透明及石蜡包埋处理，制备厚度为4 μm的组织切片，取主动脉组织石蜡包埋切片，经苏木素-伊红(HE)染色后封片，显微镜下观察并拍照分析并测量大鼠管壁厚度、平滑肌厚度。

1.5最大呼气流量(PEF)、1 s用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)水平检测 通过麦邦MSA99肺功能检测仪检测PEF、FEV1、FVC。

1.6核因子(NF)-κB信号通路蛋白表达量评价 采用Western印迹检测蛋白表达量，实验步骤：将颈部组织接种于6孔板中，测定浓度，制备电泳样品，上样量50 μg进行蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，取重叠值。采用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白为GAPDH。

1.7统计学处理 采用SPSS26.0软件进行t检验、F检验、χ2检验。

2.1各组病理组织学观察 正常组肺组织镜下观察气管管腔通畅且气管黏膜上皮未见充血及水肿，无明显炎性细胞浸润，气道平滑肌无明显增生，肺泡结构完整；
模型组大量炎性细胞浸润，支气管黏膜充血，肺泡塌陷且间隔增宽，肺泡腔内可见脱落的上皮细胞，气管腔内可见黏液及黏液栓；
药物干预后，低剂量组、中剂量组炎性细胞浸润明显减少；
高剂量组大鼠水肿程度减轻，炎性细胞浸润减少，偶尔可见少量黏液附着，基底膜较薄。见图1。

2.2各组平滑肌厚度、管壁厚度比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组平滑肌厚度、管壁厚度明显高于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组平滑肌厚度、管壁厚度明显低于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组平滑肌厚度、管壁厚度明显低于低剂量组(P<0.05)；
高剂量组平滑肌厚度、管壁厚度明显低于中剂量组(P<0.05)。见表1。

2.3各组肺功能比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组PEF、FEV1、FVC水平均显著低于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组PEF、FEV1、FVC水平显著高于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组PEF、FEV1、FVC水平显著高于低剂量组(P<0.05)；
高剂量组PEF、FEV1、FVC水平显著高于中剂量组(P<0.05)。见表1。

图1 各组病理组织学观察(HE染色，×100)

表1 各组平滑肌厚度、管壁厚度、肺功能比较

2.4各组NF-κB通路蛋白表达量比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组抑制蛋白κB(IκB)水平均明显低于正常组，NF-κB、血管内皮生长因子(VEGF)均明显高于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组IκB水平明显高于模型组，NF-κB、VEGF明显低于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组IκB水平明显高于低剂量组，NF-κB、VEGF明显高于低剂量组(P<0.05)；
高剂量组NF-κB、VEGF明显低于中剂量组，IκB水平明显高于中剂量组(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组NF-κB通路蛋白表达量比较

图2 Western印迹检测各组NF-κB通路蛋白表达

咳嗽变异性哮喘患者在运动后咳嗽程度会有所增加，临床无感染，长期抗生素治疗基本无效〔6〕。如病情长期得不到控制极易出现气道上皮组织化及气道壁增厚，咳嗽变异性哮喘类似于典型的哮喘发病机制，主要与致敏、气道重塑及气道炎症密切相关。

五味子被称为中药库中的十大“抗氧化剂”之一，五味子提取物发挥着心肌保护作用机制可能为五味子提取物能抑制过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)及O-2的产生而保护细胞膜系统免受氧自由基损害〔7〕。有研究认为〔8〕，五味子还可增强心肌细胞内核糖核酸的作用，有效提高心肌细胞等活性。另有历史记载张仲景发现并认为五味子可有效止咳，多位专家结合前人经验及临床总结中发现五味子具有较好的止咳效果。另有中医学者认为〔9〕，五味子秉酸收之性，有敛肺保肾之功。因其酸敛，则有凝痰、滞邪、聚火之弊。是故五味子所治之咳，乃肺肾不足、元气耗散之咳，取其固守金水则喘咳自止〔10〕。本研究发现，五味子提取物可明显提高气道重塑作用降低不良事件的发生，其原因可能与五味子类成分具有明显的保护细胞膜系统免受氧自由基损害的作用。

气道重塑主要的病理形态学改变是以胶原为主的细胞外基质沉积，在多位学者实验中模型组大鼠肺功能明显低于其他各组，且肺组织存在炎性细胞的浸润及水肿充血、起到平滑肌肥大、增生及上皮细胞脱落、基底膜增厚等气道重塑的病理表现，提示着咳嗽变异性哮喘存在气道重塑〔11～13〕。本研究发现，采用五味子提取物对其治疗后，各组大鼠的肺功能均得到有效改善效果气道重塑现象明显减轻，其中高剂量组的大鼠恢复效果极佳。另有学者认为〔14～16〕，五味子提取物可有效减轻气道炎症及肺组织充血、浸润及炎性细胞水肿。研究指出〔17〕，五味子提取物可有效减少气管周围胶原沉积，影响气道重塑。本研究说明，干预咳嗽变异性哮喘大鼠气道重塑可能是五味子提取物治疗的作用之一，有效改善大鼠肺功能水平。

NF-κB信号通路广泛存在于真核细胞内，参与多种基因的调控，影响细胞的分化、增殖及凋亡〔18〕。NF-κB属于一种与炎性反应关系密切的通路分子，当体内的NF-κB信号传播途径被激活以后，IκB蛋白会发生水解释放出NF-κB蛋白进入细胞核中参与对下游基因VEGF蛋白的表达〔19～21〕。以上研究证明，NF-κB信号通路可参与调节肺功能损伤后的过程，IκB在咳嗽变异性哮喘大鼠中表现为下降趋势，NF-κB、VEGF在咳嗽变异性哮喘大鼠中则表现为上升趋势，与本研究结果一致，说明NF-κB通路可在疾病发病机制中起到重要作用，并通过抑制NF-κB通路可快速抑制炎性因子的生长。