基于TLC-EFISI-MS,法的桑枝与桑叶薄层色谱鉴别研究

王路路，吴 弢

（上海中医药大学 中药研究所，上海 201203）

2020 年版《中国药典》（一部）收载的桑枝和桑叶分别来源于桑科植物桑Morus albaL.的嫩枝和干燥叶。桑枝归肝经，具有祛风湿、利关节的功效，临床常用于治疗风湿痹病[1-2]和高尿酸血症[3]等。桑叶归肝、肺经，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，常用于治疗风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花等症[1]。现代研究表明桑叶具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗炎[4]等作用。桑枝和桑叶属于同一基原不同药用部位的药材，多年来学者对两者的化学成分和药理作用进行了较为深入的研究[5-10]。在寻找两者差异性成分方面，赵婷婷等[11]采用HPLC 指纹图谱法比较桑不同药用部位的差异成分；
孙莲等[12]采用聚酰胺薄膜对桑枝和桑叶的活性成分进行鉴别；
朱志飞等[13]基于段带总量统计矩法和信息熵采用HPLC 指纹图谱法对桑源药材不同入药部位的化学成分及其印迹模板整体特征差异进行了研究，但是尚缺乏一种能实现这两种同基原药材的快速鉴别方法。

薄层色谱-静电场诱导喷雾-质谱联用法（TLCEFISI-MS）是一种通过静电场诱导喷雾电离使薄层色谱与质谱直接联用的方法，将极性溶剂滴加到经疏水处理的薄层板的相应斑点上，形成小液滴，将薄层板上的斑点经在线萃取，对小液滴施加适当的静电场，使化合物电离，并通过一根连接的毛细管将其导入质谱分析仪，解析质谱信号，对结构进行表征[14]。近年来，通过TLC-EFISI-MS 已实现了荷叶、西洋参等多种药材化学成分的鉴定[14-15]。

2020 年版《中国药典》（一部）中尚无桑枝薄层鉴别项，桑叶的薄层鉴别仅以对照药材为对照，且样品制备方法复杂。为建立具有特征性的桑叶和桑枝薄层鉴别方法，本研究拟采用TLC-EFISI-MS 寻找两者的差异成分，并以此作为指标性成分分别建立桑枝和桑叶的薄层鉴别方法，为改进桑枝和桑叶这两种同基原药材的质量控制方法提供科学依据。

1.1 仪器

Automatic-4 型薄层色谱全自动点样仪，配备Visualizer-2 型薄层色谱成像仪和TLC plate heater Ⅲ型薄层硅胶板加热器（瑞士CAMAG 公司）；
LTQ 型离子阱质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific）；
熔融石英毛细管（0.15 mm ID，0.22 mm OD，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 试剂

高效GF254硅胶预制薄层板（烟台市化学工业研究所）；
高效硅胶预制薄层板（青岛海洋化工厂）；
硅胶GF254预制薄层板（DC-Fertigplatten DURASIL-25，MN）；
高效硅胶GF254预制薄层板（HPTLC-Fertigplatten Nano-DURASIL-20，高效MN硅胶薄层板）；
高效硅胶GF254预制薄层板（HPTLC Silica gel 60 F254，高效Merck 硅胶薄层板）；
甲醇、正丁醇、乙酸、95%乙醇、氯化铝、乙酸乙酯、98%甲酸、硫酸、碘化钾、碘、次硝酸铋、二甲基硅油（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
桑皮苷A 对照品（纯度：98%，批号：ST05680120，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；
紫云英苷对照品（纯度：98%，批号：P27A11F122504，上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 药材

10 个不同批次的桑枝和桑叶药材，经上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定为桑科植物桑Morus albaL.的嫩枝和干燥叶。具体信息见表1。

表1 桑枝和桑叶样品信息Tab. 1 Sample information of Mori Ramulus and Mori Folium

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 桑皮苷A 对照品溶液：取桑皮苷A 对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 mg/mL 的对照品溶液。

紫云英苷对照品溶液：取紫云英苷对照品适量，精密称定，加乙醇制成1 mg/mL 的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 桑枝供试品溶液：取桑枝药材粉末（过三号筛）1 g，精密称定，加70%乙醇15 mL，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL 甲醇使溶解，作为桑枝供试品溶液；
同法制成其对照药材溶液。

桑叶供试品溶液：取桑叶粉末（过三号筛）1 g，精密称定，加乙醇15 mL，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使完全溶解，作为桑叶供试品溶液；
同法制成其对照药材溶液。

2.1.3 显色剂的配制 改良碘化铋钾试液：取碘化铋钾试液1 mL，加0.6 mol/L 盐酸溶液2 mL，加水至10 mL，即得。

5%三氯化铝-乙醇溶液：取5 g 三氯化铝，加乙醇溶解，定容至100 mL，即得。

2.2 桑枝和桑叶差异成分的考察

桑叶和桑枝中的生物碱具有很好的药理活性，尤其是在降血糖方面尤为突出[16-20]。研究表明，桑枝总生物碱可通过调节肠道微生态、促进胰岛素的分泌而发挥抗糖尿病的作用[21]。目前，由我国自主研发的降血糖药物桑枝总生物碱片已上市[18]。因此，本实验首先考察桑枝和桑叶中的生物碱类成分，以期从中找到两者的差异成分。

据文献[22]报道，桑类药材中生物碱成分多为野尻霉素衍生物，含较多羟基，极性较大，可溶于水、醇类溶剂，因此以水为溶剂对桑枝、桑叶中生物碱成分进行提取。分别取桑叶（SY-01、SY-04）、桑枝（SZ-01、SZ-02）粉末（过三号筛）1 g，精密称定，加水15 mL 超声提取（功率：300 W，频率：40 kHz）20 min，8 000 r/min 离心，取上清液1 mL 为供试品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶2∶1，V/V/V）展开约至8 cm，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液显色后，置日光灯下检视。桑叶和桑枝均主要含有一个相同的生物碱成分斑点（Rf = 0.1），见图1A。表明在该薄层色谱条件下，色谱斑点较少，且其生物碱类成分无法区别桑叶和桑枝。由于桑叶和桑枝除生物碱外，还含有丰富的黄酮和酚性化合物。因此，本研究还通过改变展开剂和显色剂来寻找两者的区别斑点。以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）为展开剂，5%三氯化铝-乙醇溶液显色，置紫外光灯（366 nm）下检视，在该色谱条件下，两者在Rf 值0.2 ～ 0.8 的范围内出现多个分离度较好的色谱荧光斑点，且桑枝和桑叶表现出明显不同的薄层斑点轮廓，同时发现斑点S1 和S2 可作为桑枝和桑叶的差异成分，见图1B。

图1 桑枝和桑叶差异成分的考察Fig. 1 The differential components of Mori Ramulus and Mori Folium

2.3 TLC-EFISI-MS 表征桑枝和桑叶中的差异成分

为了对上述薄层色谱中桑枝和桑叶薄层色谱鉴别成分S1 和S2 的结构进行鉴定，本研究采用课题组前期建立的TLC-EFISI-MS 联用法对薄层斑点进行结构表征[14]。具体方法如下：分别取“2.2”项下制备的桑叶（SY-01）、桑枝（SZ-01）供试品溶液各10 μL点于薄层板上，同一板上平行2 份，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）上行展开，取出晾干后，用切板器分成2 块，一块用5%三氯化铝-乙醇显色剂显色，一块不显色，将两块板的斑点Rf 值进行比较后在非显色板上标出质谱鉴定斑点的准确位置，之后再将该薄层板用二甲基硅油-正己烷（1 ∶1，V/V）浸润后经质谱直接分析。

质谱条件：以静电场诱导喷雾离子化为离子源，质谱毛细管电压为40 V，质谱毛细管温度为275 ℃，质谱透镜电压为250 V，传输毛细管到质谱入口距离为2 ～ 5 mm，诱导电压：正离子模式为4 kV，负离子模式为-4 kV。采用碰撞诱导电离的多级质谱碎裂模式，归一化碰撞能量为15 ～ 20 eV。以甲醇-水（1 ∶1，V/V）为溶剂对薄层板上的目标成分进行提取。

通过对未显色薄层板上标记的斑点S1 和S2 进行在线TLC-MS 联用分析，斑点S1 的一级质谱峰出现准分子离子峰m/z591 [M+Na]+，其二级质谱和三级质谱分别出现m/z429 [M+Na-162]+和m/z267 [M+Na-162-162]+等碎片离子峰，表明该化合物中含有两个六碳糖，该准分子离子、质谱裂解规律与文献报道的桑枝中的桑皮苷A 一致[23]，见图2。斑点S2 的一级质谱图中出现准分子离子峰m/z447 [M-H]-，其二级质谱中出现碎片离子峰m/z284 [M-H-162]-，表明该化合物中含有一个六碳糖，且m/z284 的碎片离子与山柰酚一致。该斑点的准分子离子峰及碎片、质谱裂解规律与文献报道的桑叶中紫云英苷一致[24]。以桑皮苷A 和紫云英苷对照品进行验证，结果表明S1 和S2 的Rf 值和显色行为分别与其对照品一致，表明该TLC-MS 法对两者结构表征准确。因此，分别以桑皮苷A 和紫云英苷为桑枝和桑叶的特征鉴别点，建立其薄层色谱鉴别方法。

图2 桑枝斑点 S1 的 MS1-3（A）和桑叶斑点 S2 的 MS1-2（B）质谱图Fig.2 MS1-3 of spot S1 in Mori Ramulus (A) and MS1-2 of spot S2 in Mori Folium (B)

2.4 展开系统的考察

按“2.1”项下方法制得桑皮苷A 对照品溶液（S1）、桑枝对照药材溶液（R1），取桑枝药材粉末（SZ-01、SZ-02），制得桑枝供试品溶液（Z1、Z2），将上述制得的溶液点样于同一硅胶GF254薄层板上，分别以乙酸乙酯- 甲酸- 冰醋酸- 水（10 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）、二氯甲烷-甲醇-水（9 ∶1 ∶0.1，V/V/V）、正丁醇-乙酸乙酯-水（10 ∶1 ∶1，V/V/V）为展开剂，展距约为8 cm，取出，晾干，置紫外灯（366 nm）下检视，结果如图3（A1 ～ A3）所示：以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（10 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）为展开剂时，其鉴别点S1（Rf = 0.20）分离度较好；
按“2.1”项下方法制得紫云英苷对照品溶液（S2）、桑叶对照药材溶液（R2），取桑叶药材粉末（SY-01、SY-04），制得桑叶供试品溶液（Y1、Y2），将上述制得的各溶液点样于薄层板后，分别以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）、乙酸乙酯-甲酸-水（10 ∶2 ∶1，V/V/V）、正丁醇-乙酸乙酯-水（10 ∶1 ∶1，V/V/V）展开，展距约为8 cm，取出，晾干，以5%三氯化铝-乙醇溶液显色后，置紫外灯（366 nm）下检视，结果如图3（B1 ～ B3）所示：以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）为展开剂时，桑叶样品中各斑点显色较清晰，其鉴别点S2（Rf = 0.68）有较好的分离度。因此选用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（10 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）作为桑枝薄层鉴别的展开剂，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）为桑叶薄层鉴别的展开剂。

展开系统不但要能使样品中的各斑点有好的分离度，而且能区分桑枝和桑叶。因此，将桑叶药材粉末（SY-01），按“2.1”项下桑枝供试品溶液制备方法，制成桑叶供试品溶液（Y3）。同时，取桑枝药材粉末（SZ-01），按“2.1”项下桑叶供试品溶液制备方法，制成桑枝供试品溶液（Z3）。取桑皮苷A 对照品溶液（S1）、桑枝对照药材溶液（R1）、桑枝供试品溶液（Z1）、桑叶供试品溶液（Y3）适量，点样于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（10 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）展开后，置紫外灯（366 nm）下检视，如图3A4 所示：在桑叶供试品溶液中与桑皮苷A 相同Rf 位置上，无相应斑点；
此外，将紫云英苷对照品溶液（S2）、桑叶对照药材溶液（R2）、桑叶供试品溶液（Y1）、桑枝供试品溶液（Z3）适量，点样于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）为展开剂，以5%三氯化铝-乙醇溶液显色后，置紫外灯（366 nm）下检视，如图3B4 所示：桑枝供试品溶液中与紫云英苷相同Rf 位置上，未出现相应斑点，说明该展开剂可用于区分桑枝、桑叶药材。

图3 桑枝和桑叶薄层色谱展开系统的考察Fig. 3 Optimization of developing solvents for TLC of Mori Ramulus and Mori Folium

2.5 《中国药典》中桑枝、桑叶鉴别方法的优化

2020 年版《中国药典》（一部）“桑枝”项下无薄层鉴别项。“桑叶”项下有薄层鉴别，但是提取方法繁琐，具体操作方法为取桑叶粉末2 g，加石油醚（60 ～ 90 °C）30 mL，加热回流30 min，弃去石油醚液，药渣挥干，加乙醇30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加热水10 mL，置60 °C 水浴上搅拌使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇l mL 使溶解，作为供试品溶液。另外《中国药典》中桑叶的薄层鉴别用对照药材进行对照；
薄层展开剂是“甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶2 ∶1，V/V/V）的上层溶液”，其中甲苯为致癌物，对人体危害较大，且使用该展开剂得到的桑叶斑点信息量较少；
检视方法是置紫外灯（365 nm）下检视。为了考察《中国药典》的方法是否能够区别桑枝和桑叶，我们分别取桑叶（SY-01、SY-04）、桑枝（SZ-01、SZ-02）药材粉末，按《中国药典》中桑叶薄层鉴别项的方法制备桑叶、桑枝供试品溶液（Y1、Y2、Z1、Z2），以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶2 ∶1，V/V/V）的上层溶液为展开剂展开后，直接在紫外灯（366 nm）下检视，见图4A，以5%三氯化铝-乙醇溶液显色后，置紫外灯（366 nm）下检视，见图4B。结果表明：使用该方法桑枝、桑叶样品薄层显色行为一致，不能有效区分桑枝和桑叶。针对以上问题，将《中国药典》中繁琐的提取方法优化为乙醇超声提取20 min，同时将展开剂改为毒性较低的乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V），增加紫云英苷对照品，检视方法改为5%三氯化铝-乙醇溶液显色后，置紫外灯（366 nm）下检视。优化后的方法简化了药材提取步骤，降低了试剂毒性，斑点信息丰富，且方法专属性较好，可有效区分桑枝、桑叶。

图4 考察《中国药典》方法区分桑枝和桑叶的薄层色谱图Fig. 4 TLC of Mori Ramulus and Mori Folium by the Chinese Pharmacopoeia method

2.6 桑枝的薄层色谱鉴别

取10 批不同批次的桑枝药材粉末（SZ-01 ～ SZ-10），按“2.1”项下溶液制备方法制得桑皮苷A 对照品溶液、桑枝供试品溶液、对照药材溶液。取桑皮苷A 对照品溶液1 μL，桑枝供试品溶液、对照药材溶液各2 μL 点于同一HPMN 硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（10 ∶1 ∶1 ∶2，V/V/V/V）展开后，于紫外灯（366 nm）下检视，该薄层板的斑点较为清晰，10 个不同批次的供试品溶液与对照品桑皮苷A 溶液的相对应位置上均能显示相同颜色的斑点，见图5。

图5 10 批桑枝药材薄层色谱图Fig. 5 TLC for 10 batches of Mori Ramulus

2.7 桑叶的薄层色谱鉴别

取10 个不同批次的桑叶药材粉末（SY-01 ～SY-10），按“2.1”项下溶液制备方法制得紫云英苷对照品溶液、桑叶供试品溶液、对照药材溶液。取紫云英苷对照品溶液0.5 μL，桑叶对照药材溶液、供试品溶液2 μL，分别点于同一HPMerk 硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10 ∶1 ∶0.3 ∶1，V/V/V/V）展开后，喷以5%三氯化铝-乙醇溶液，加热至显色，置紫外灯（366 nm）下检视。与对照品相应位置上，10 批供试品溶液中均出现相同颜色斑点，斑点显色清晰，分离度好，见图6。

图6 10 批桑叶药材薄层色谱图Fig. 6 TLC for 10 batches of Mori Folium

3.1 指标成分的选择

桑皮苷A 是二苯乙烯苷类成分，主要存在于桑属植物中，研究表明其具有抗氧化[25]及镇痛抗炎[26]等活性；
紫云英苷是黄酮类化合物，具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗癌等药理作用[27]。本研究通过TLC-EFISI-MS 联用法发现的桑皮苷A 和紫云英苷不仅与其所在的药材功效相关，而且能够很好地将桑枝和桑叶区别开来，具有一定专属性。因此，选用桑皮苷A 和紫云英苷为桑枝、桑叶薄层鉴别的指标成分，分别建立桑枝和桑叶的薄层鉴别方法。

3.2 桑枝薄层色谱条件考察

通过对桑枝的提取溶剂：甲醇、80%甲醇、95%乙醇、70%乙醇、水进行考察，结果表明，以95%乙醇和水为提取溶剂时，样品中各成分含量较少，以甲醇、80%甲醇和70%乙醇为溶剂时，斑点较多，显色清晰，相对于甲醇而言，70%乙醇为环境友好型试剂，所以选择70%乙醇为提取溶剂。考察了超声、加热回流、冷浸的提取方法，结果显示：三种提取方法斑点的数量和含量较为接近，而超声提取的方法简便、易操作，因此选取超声法进行提取。对显色方式进行考察，未喷显色剂以及采用5%三氯化铝-乙醇溶液、10%硫酸-乙醇溶液为显色剂的薄层色谱图比较表明：用显色剂显色后各斑点较显色前模糊，因此选择未显色时在紫外灯（366 nm）下检视；
对烟台硅胶薄层板、青岛海洋硅胶薄层板、MN 以及高效MN 硅胶薄层板四种硅胶板进行了考察，结果表明，以上四种薄层板均可以用于桑枝的鉴别，但烟台硅胶薄层板、MN 及高效MN 硅胶薄层板较青岛海洋硅胶薄层板斑点显色清晰，高效MN 硅胶薄层板较烟台硅胶薄层板、MN 硅胶薄层板分离度更好，因此本研究选用高效MN 硅胶薄层板；
最后对点样量进行了考察，结果显示：选用对照品点样量为1 μL，对照药材、样品溶液点样量为2 μL 较为适宜。

3.3 桑叶薄层色谱条件考察

通过对桑叶的提取溶剂（甲醇和乙醇）进行考察，结果发现：两种溶剂提取效果差异不大，由于乙醇绿色无害，因此选用乙醇为提取溶剂。考察了超声、加热回流、冷浸等三种提取方法，结果显示，加热回流法提取效率较超声法和冷浸法高，但该法提取的杂质含量较高，干扰目标化合物的分离，因此选用超声法提取。对点样量进行了考察，结果表明：对照品点样量为0.5 μL，供试品溶液及对照药材溶液点样量为2 μL 为宜；
对烟台硅胶薄层板、MN 以及高效MN 硅胶薄层板、高效Merck 硅胶薄层板进行了考察，结果显示，四种薄层板均能较好进行鉴别，但高效Merck 硅胶薄层板斑点分离度较好且较为美观。

本研究通过TLC-EFISI-MS 法发现并鉴定了桑枝和桑叶的差异成分，并在此基础上，建立了桑枝的专属薄层鉴别方法，填补了2020 年版《中国药典》（一部）中无桑枝薄层鉴别项的空白。同时简化了样品提取方法，并修订展开剂为乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水，新增了紫云英苷为专属对照品，将检视方法改为5%三氯化铝-乙醇溶液显色后置紫外灯（366 nm）下检视，改进后的薄层鉴别方法和《中国药典》方法比较，操作简便、薄层斑点信息多、分离度良好。采用该方法对10 批桑枝和桑叶药材进行了薄层色谱鉴别，结果表明该鉴别方法重复性好、斑点信息丰富，可作为桑枝和桑叶的薄层鉴别方法。