碱性条件高效降解小麦秸秆菌群的筛选及酶活力特点

佟旭楠，洪梓萌，白狄纯，旦增卓嘎，王金龙

(天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392)

农作物秸秆是指作物收获之后残留的根、茎、叶部分。中国的秸秆产量达到了9亿吨[1]，其中三大主要作物的秸秆总产量占比最高，共占秸秆总产量的83.51%[2]。作物秸秆是一种可再生的资源，大部分秸秆被焚烧，造成生物资源浪费，也造成生态环境问题；
而秸秆就地还田常常表现为秸秆降解慢，影响下茬作物的生长。因此，寻找一种安全有效省时省力的秸秆处理方式，对秸秆的有效利用具有重要意义。近年来，利用微生物有效降解作物秸秆，使秸秆发挥其有效价值，提高其利用率，既环保又利于农业可持续发展，成为农业生态学研究的热点领域[3-6]。

秸秆中的木质纤维素等难分解物质降解的快慢是秸秆改善土壤肥力和促进后续作物生长的决定因素。早期的研究者采用向土壤中施加外源纤维素酶来促进秸秆的降解，然而这种措施由于成本较高而不利于在实际生产中推广。微生物是植物凋落物和作物秸秆的主要分解者之一，且微生物具有相应的高效的酶系统，如纤维素酶。因此，通过选择在某种特异条件具有高酶活性的微生物或者复合微生物菌群来加速还田秸秆的分解，成为促进都市农业绿色可持续高质量发展的重要措施之一。如，Gaind & Nain[7]将两种真菌接种到还田秸秆中，可加速秸秆降解。我国地域辽阔，土壤环境多样。其中，盐碱化耕地面积达到9.578 4×104hm2，约占耕地总面积的6.62%。因此，筛选适宜于碱性土壤中的微生物菌群的相关工作值得研究者的广泛关注。

本研究在构建降解小麦秸秆复合菌群的基础上，测定复合菌群羧甲基纤维素酶(CMCase)、滤纸酶(FPA)、木聚糖酶(Xylanase)和漆酶(Laccase)活性在系列偏碱性培养条件下的活动变化，筛选降解小麦秸秆的高效复合菌群，为碱性土壤地区的小麦秸秆还田土壤改良提供技术支持和理论指导。

1.1 试验材料

本试验所用秸秆材料为采自天津市宝坻区长期定位试验田的小麦秸秆，用秸秆粉碎机磨碎、灭菌后用于后续试验。

通过查阅相关文献，选取对碱性环境下对秸秆分解有应用潜力的黑曲霉(Aspergillusniger)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、扩展青霉(Penicilliumexpansum)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和里氏木霉(Trichodermareesei)作为微生物材料。它们均能够降解秸秆并对作物生长有促进作用。其中，除苏云金芽孢杆菌为细菌外，其余6种均为真菌，这些微生物材料购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(http://www.cgmcc.net)。

通过平板对峙培养，筛选无拮抗作用的两两菌种配置成复合菌剂。本试验共配置8组复合菌剂，分别为：黑曲霉+黄孢原毛平革菌(An+Pc)、黑曲霉+草酸青霉(An+Po)、苏云金芽孢杆菌+黄孢原毛平革菌(Bt+Pc)、苏云金芽孢杆菌+草酸青霉(Bt+Po)、黄孢原毛平革菌+扩展青霉(Pc+Pe)、黄孢原毛平革菌+哈茨木霉(Pc+Th)、黄孢原毛平革菌+里氏木霉(Pc+Tr)、哈茨木霉+里氏木霉(Th+Tr)。

1.2 试验设计

1.2.1 不同复合菌群酶活性的比较研究

本试验采用单因素试验设计，试验因素为8组不同的复合菌群，每个菌群重复3次。将不同种类的复合菌群菌液5 mL(约108个孢子；
两种菌群的比例为1∶1)分别加入已经灭菌的装有100 mL PDA液体培养基(pH 9.0；
含有1%前期粉碎处理的小麦秸秆)的250 mL的三角瓶中，25 ℃，120 r/min摇床中培养，培养96 h后，取样测量羧甲基纤维素酶活力(CMCase)、滤纸酶活力(FPA)、木聚糖酶活力(FPA)和漆酶活力(Laccase)。

1.2.2 培养基初始pH对代表性复合菌群酶活力的影响

本试验采用单因素试验设计，试验因素为培养基初始pH，包括pH 8.0和pH 9.0两种水平，每种处理重复3次。选择黄孢原毛平革菌+扩展青霉(Pc+Pe)这组复合菌群为研究对象，在如1.2.1相同的试验条件下培养。120 h后，测量如同1.2.1的四种酶活力。

1.2.3 培养时间对代表性复合菌群酶活力的影响

本试验采用单因素实验设计，试验因素为培养时间，包括24、48、72、96和120 h共5个采样时间，每次采样重复3次。选择黄孢原毛平革菌+扩展青霉(Pc+Pe)这组复合菌群为研究对象，在如1.2.1相同的试验条件下培养，每隔24 h取样测量如同1.2.1的四种酶活力，连续测定5次。

1.3 试验方法

羧甲基纤维素酶活力(CMCase)、滤纸酶活力(FPA)、木聚糖酶活力(FPA)的测定均采用DNS比色法测定，1mg C6H12O6/h记作1个酶活力单位(U)[8]。漆酶活力(Laccase)活力测定采用ABTS分光光度计法测定，1 μmol ABTS/min记作1个漆酶单位(U)[9]。

1.4 数据分析

利用单因素方差分析中的多重比较来检验不同复合菌群对四种酶活力的影响以及培养时间对四种酶活力的影响；
利用独立样本t检验来检验两种初始培养基pH对四种酶活力的影响。以上分析利用软件SPSS 22.0 (IBM, Chicago, IL, USA)进行，并利用Excel 2016进行图表制作。

2.1 不同复合菌群酶活力的比较研究

基于羧甲基纤维素酶活力的测定结果可知：An+Pc以及Pc+Pe两种处理条件下所得酶活力显著高于An+Po，Bt+Pc和Bt+Po处理，而Bt+Pc和Bt+Po两种处理显著低于除Th+Tr外的所有处理(图1A)。基于滤纸酶活力的测定结果可知：Pc+Pe、Pc+Th和Pc+Tr三种处理条件下所得酶活力最高，而An+Po处理条件下所得酶活力最低(图1B)。基于木聚糖酶活力的测定结果可知，处理间对该酶活力无显著影响(P>0.05)(图1C)。基于漆酶活力的测定结果可以发现，An+Pc处理条件下所得酶活力最低，显著低于An+Po、Bt+Po、Pc+Pe、Pc+Th和Pc+Tr(P<0.05)，而与Bt+Pc和Th+Tr间无显著差异(P>0.05)(图1D)。

2.2 培养基初始pH对代表性复合菌群酶活力的影响

独立样本t检验结果表明(图2)：在培养基初始pH 8.0 和pH 9.0两种处理条件下，滤纸酶、木聚糖酶和漆酶活力无显著差异(P>0.05)；
仅羧甲基纤维素酶之间差异显著(P<0.001)，表现为pH 8.0处理条件下所得结果显著高于pH 9.0所得结果，约为pH 9.0处理条件下所得结果的4倍。

2.3 培养时间对代表性复合菌群酶活力的影响

单因素方差分析结果表明(图3)，培养时间对羧甲基纤维素酶和滤纸酶活力影响显著(P<0.05)。随着培养时间的延长，这两种酶活力逐渐增加，并于96 h达到最大值，随后急速下降。而培养时间对木聚糖酶和漆酶活力无显著影响(P>0.05)。

图1 复合菌群间四种酶活力比较(A: 羧甲基纤维素酶；
B: 滤纸酶；
C: 木聚糖酶；
D: 漆酶)Figure 1 Comparisons of enzyme activities of composition microbes(A: CMCase；
B: FPA；
C: Xylanase；
D: Laccase)

图2 培养基初始pH对代表性复合菌群酶活力的影响(***表示在0.001水平下差异显著)Figure 2 Effects of initial pH value on enzyme activity of the representative compound microbes with wheat straw (*** indicates significant difference at 0.001 level.)

图3 培养时间对代表性复合菌群酶活力的影响Figure 3 Effects of culture time on enzyme activity of the representative compound microbes with wheat straw

秸秆降解菌的产酶能力往往会受到环境因素，如培养时间、培养温度和培养基pH等的影响。本研究所用代表性菌群在偏碱性培养基中培养，羧甲基纤维素酶和滤纸酶活力受培养时间影响显著，且均在4 d(96 h)达到最高值(图3)。而相似的研究中多支持4～6 d为复合菌群酶活力较高的时期，如张悦等[10]研究发现，复合菌群Pelomonasgx.+Curvibacterzj.产酶能力明显高于单一菌株，且在温度35 ℃、pH 6.5的条件下培养4 d时的酶活力最高；
而李文学等[11]从四川成都平原多年秸秆还田的土壤中筛选得到了复合菌系WSS-1，该菌群CMCase活力在6 d左右最高。基于这些酶均为重要的纤维素分解酶，在秸秆分解后期发挥重要的作用，因此对判断培养时间对酶活力的作用时具有较为重要的参考价值，也是指导实践的重要依据。

已有许多研究表明纤维素酶在偏酸性环境下活性较高，如王双等[12]筛选出的曲霉菌属LK8(Aspergilluscf.flavipesATUS)、青霉菌属LK10(Penicilliumsp. LH33)在pH 6.0时产酶性能最好，降解能力较强。而本研究结果表明黄孢原毛平革菌+扩展青霉(Pc+Pe)复合菌群即使pH 9.0条件下也能很好地生长，且仅羧甲基纤维素酶活力在pH 9.0条件下显著下降，而其他三种酶活力在pH 8.0和pH 9.0之间并无显著差异(图2)。此外，也有研究发现一些微生物更适宜于偏碱性环境，如孙学花等[13]利用黑曲霉、里氏木霉等8种菌对小麦秸秆进行模拟田间腐解进程时，发现这些酶的生长适宜pH为8.1；
裴宇航[14]在研究玉米秸秆降解菌的特性时发现，初始培养基在pH 3.5至pH 8.0等间隔10种处理中，经发酵培养9 d后，所得最终pH均有所提升，且初始pH高于5.0的7种处理条件下最终pH均高于7.0，并指出复合菌群生长活动对培养液pH的影响较小，培养液pH能够在上升一段时间后保持稳定，而单一菌群需要不断地投加pH缓冲剂来控制培养液pH，该研究所选复合菌的最适产酶pH为7.5。以上研究支持部分复合菌群在偏碱性环境下也能很好发挥秸秆降解的作用，且比单一菌群具有相对稳定的特点，通过试验筛选可以得到适合碱性土壤条件下的用于秸秆分解的复合菌群。

通过不同复合菌群酶活力的差异比较，可以筛选得到高活力的复合菌群。就本研究而言，pH 9.0培养条件下，黄孢原毛平革菌+扩展青霉(Pc+Pe)复合菌群四种酶活力均最高，且在观测的4种酶活力中，有三种酶活力在pH 8.0和pH 9.0处理间无显著差异，表现出较好的偏碱性环境的耐受性。这为偏碱性土壤小麦秸秆还田的有效利用提供了试验数据和理论指导。