2,型糖尿病合并白内障患者晶状体上皮细胞中PEDF和VEGF的表达及意义

胡亚茹，陈 悦，韩 雪，陈亚茹，马竹宇，王剑锋

白内障的发病机制复杂，目前仍未完全明确。年龄相关性白内障被认为是晶状体衰老过程，同时伴随晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)功能性状改变和多种细胞因子的表达异常。研究表明色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)表达与衰老有密切的关系[1]。刘恬等[2]研究发现6岁以下的先天性白内障LECs中PEDF的表达水平远高于50岁以上年龄相关性白内障，提示PEDF的表达下调可能导致晶状体的老化，下调程度随着晶状体的混浊程度加重进一步加重。糖尿病患者更容易发生白内障，具体机制尚不确切，本研究通过检测2型糖尿病合并年龄相关性白内障患者LECs中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和PEDF表达水平，探讨2型糖尿病合并年龄相关性白内障的发病机制，为预防和减缓糖尿病患者发生白内障提供新的途径。

1.1对象回顾性研究。选择2020-08/2021-04在蚌埠医学院第一附属医院眼科就诊并实施手术的2型糖尿病合并年龄相关性白内障和年龄相关性白内障患者各30例30眼。纳入标准：(1)年龄50～80岁；
(2)白内障病史大于1a；
(3)均符合白内障诊断标准，并且均有手术指征，无影响视力的严重并发症；
(4)白内障核硬度分级[3-4]≥Ⅱ级；
(5)手术均顺利；
(6)晶状体后囊膜完整；
(7)2型糖尿病合并年龄相关性白内障患者糖尿病病史大于1a，血糖水平控制平稳，术前未发现糖尿病视网膜病变。排除标准：(1)合并增殖性糖尿病视网膜血管疾病、视神经炎、葡萄膜炎、高度近视、青光眼等病史；
(2)合并除糖尿病之外的其它系统性疾病；
(3)合并严重干眼；
(4)过熟期白内障；
(5)有眼部外伤、手术及眼底激光史；
(6)临床资料不完整。所有患者均知情同意，并已通过蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会审批。

1.2方法

1.2.1主要试剂和仪器Trizol试剂(购自Invitrogen公司)、SYBR®Green(Takara公司)、ECL化学发光试剂盒(Millipore公司)、逆转录试剂(ThermoFisher公司)、蛋白浓度检测试剂盒(碧云天公司)；
VEGF和PEDF抗体(Proteintech公司)，HRP标记抗体(Biosharp公司)；
Tecan M1000多功能酶标仪(美国Bio-Tex公司)、组织研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)、Real-time PCR仪(7500)(美国ABI公司)、Nanpdrop one超微量核酸蛋白浓度测定仪(ThermoFisher公司)。

1.2.2标本采集常规白内障超声乳化吸除术中连续环形撕囊，撕除晶状体中央5.5～6.0mm的前囊膜(含LECs)，将切口处的血擦干净，再将囊膜从切口取出，然后用生理盐水冲洗，清除囊膜表面残留的黏弹剂、血迹、房水；
将囊膜分为2份，两份大小尽量相似，一份立即放入无菌EP管中，-80℃冰箱保存，用于蛋白检测。另一份放入含Trizol的EP管-20℃冰箱保存以进行mRNA的检测。

1.2.3qRT-PCR检测LECs中VEGF和PEDFmRNA的表达因单个囊膜中蛋白和RNA含量较少，根据预实验统计处理结果，标本按相近原则将10例囊膜标本(每例为半个囊膜)合并为1组样本。使用组织碾磨机对两组样本进行粉碎性碾磨，用Trizol法提取两组标本的总RNA，20μL的DEPC液进行溶解，然后测量两组RNA的浓度及纯度，RNA纯度较好时根据不同的RNA浓度逆转录成RNA对应的第一链cDNA。逆转录完成后按照相同比例对其进行适当稀释，同时按照引物说明书将引物浓度稀释至10μmol/L，震荡混匀之后进行qRT-PCR加样和上机，检测VEGF和PEDF mRNA的相对表达量。独立重复实验3次。

1.2.4Western-blot检测LECs中VEGF和PEDF蛋白的含量标本按相近原则将10例囊膜标本(每例为半个囊膜)合并为1组样本。使用组织碾磨机对两组样本进行粉碎性碾磨，加入裂解液对组织进行裂解，提取总蛋白,然后以标准BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量。按照Western-blot标准程序进行制胶、上样、电泳、转膜和显色，最后等体积混合A液和B液(0.5mL：0.5mL)配制成ECL发光液并以凝胶成像系统进行曝光成像,用Image J软件对条带进行灰度分析，观察VEGF和PEDF蛋白的表达情况。晶状体囊膜标本按相近原则将10例合并为1组样本，独立重复实验3次。

2.1两组患者一般资料比较本研究共纳入年龄相关性白内障和2型糖尿病合并年龄相关性白内障患者各30例。两组患者性别及晶状体核硬度，差异均无统计学意义(P>0.01)，两组患者年龄比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2两组患者LECs中VEGF和PEDFmRNA表达情况两组患者LECs中均存在VEGF、PEDF的表达。2型糖尿病合并年龄相关性白内障组中VEGF mRNA表达水平高于年龄相关性白内障组，差异有统计学意义(P<0.01)；
而2型糖尿病合并年龄相关性白内障组中PEDF mRNA水平低于年龄相关性白内障组患者，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 两组患者LECs中VEGF和PEDF mRNA及蛋白的表达情况

2.3两组患者LECs中VEGF和PEDF蛋白表达情况2型糖尿病合并年龄相关性白内障组患者LECs中VEGF蛋白的表达量高于年龄相关性白内障组患者，差异有统计学意义(P<0.01)；
2型糖尿病合并年龄相关性白内障组患者LECs中PEDF的蛋白表达量低于年龄相关性白内障组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

与年龄相关性白内障相比，糖尿病患者白内障发生早，进展快，是糖尿病主要并发症之一，发病机制目前尚不清楚，近年研究其与多种细胞因子的表达异常有关。VEGF是新生血管形成的强效诱导因子，可由多种细胞分泌，刺激新生血管生长，大量研究主要聚焦在糖尿病视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性等眼部新生血管性疾病，呈高表达状态。PEDF是一种多效能多肽因子[5]，分布于全身多种组织并参与其生理病理过程，1999年Dawson等[6]首次发现PEDF具有很强的血管抑制作用，对多种血管生成刺激因子具有活性。PEDF已在眼内多种组织中检测到，调节正常血管状态及视网膜分化，角膜、玻璃体等眼内无血管组织透明非血管状态的维持可能与PEDF有关[7]。

PEDF与VEGF被公认为是一对新生血管生成调控因子，大量研究证明这一对因子在视网膜新生血管相关疾病中发挥着重要作用。PEDF与VEGF具有相反的作用，当PEDF表达下降时，VEGF表达水平升高，二者之间相互制约，相互调节，在正常视网膜组织中VEGF、PEDF的表达维持在一定的水平，参与视网膜某些正常生理功能，两者保持着平衡，相互制约。当患者由于高血糖、血管阻塞等原因，使视网膜微循环障碍，导致视网膜缺血，两者之间的平衡关系被打破，视网膜组织中VEGF表达升高，PEDF表达减少，在非增殖期和临床前期视网膜血管病变中发挥了重要的作用，并促进了糖尿病视网膜病变的发展[8]。汪浩等[9]观察2型糖尿病患者房水中VEGF水平升高，PEDF表达水平明显降低，提示糖尿病患者房水中存在VEGF与PEDF的失衡，可能与糖尿病视网膜病变的发生、发展有关。陈艳文[10]观察糖尿病合并白内障患者房水中VEGF及炎性因子IL-6、IL-8的表达明显升高，我们以前的研究结果也显示糖尿病合并白内障患者房水中IL-6、VEGF的表达升高，并与术后黄斑水肿有一定的相关性，提示炎症反应及眼内VEGF水平的变化与糖尿病患者白内障的发生有密切相关性[11]。

2005年Segev等[12]利用cDNA微阵列技术发现人晶状体前囊下的LECs中存在PEDF。进一步研究发现PEDF的表达位于LECs胞浆内[13]。根据在其它组织细胞中PEDF生物学特性的研究结果[14-15]，PEDF可反映细胞增殖潜能，而且在细胞周期复杂的调控网络中起负性效应，是表达广泛的细胞生存/保护因子。晶状体作为一个无血管组织，认为晶状体中合成与表达PEDF是为了维持无血管化，推测PEDF的存在可能是晶状体在进化过程中获得的血管生成抵御机制。

刘恬等[16]检测到6岁以下的先天性白内障LECs中PEDF的表达水平远高于50岁以上年龄相关性白内障，提示PEDF的表达下调可能导致晶状体的老化。进一步研究发现年龄相关性白内障前囊下LECs中PEDF的蛋白和基因表达及其水平随着晶状体混浊程度的增加呈下降趋势[14]。糖尿病患者更容易发生白内障，具体机制尚不确切，既往研究结果显示糖尿病患者房水中存在VEGF与PEDF的失衡，糖尿病白内障患者晶状体上皮细胞中PEDF、VEGF的表达水平是否存在同样的变化，尚未见报道。本研究结果显示与年龄相关性白内障患者相比，2型糖尿病合并白内障患者LECs中的VEGF的表达水平升高，相反PEDF的表达水平明显降低，与以往研究的糖尿病患者视网膜组织、房水中的变化趋势一致[8-10]，因此我们推测2型糖尿病合并白内障患者LECs中也同样存在PEDF、VEGF表达的失衡，并且比年龄相关性白内障的平衡失调更明显，这种平衡的明显失调可能导致了糖尿病患者更早发生白内障、并且进展更快。干预眼内PEDF、VEGF水平可能为预防和减缓糖尿病患者发生白内障提供新的途径，也为糖尿病视网膜病变的治疗提供更长的时间窗。