从Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3信号通路探讨牛磺酸对Aβ25-35所致神经干细胞损伤的保护作用

李婷君，王晶

阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）是一种表现为认知与记忆功能减退的神经系统退行性疾病，β-淀粉样蛋白（β-amyloidpeptide，Aβ）异常沉积形成老年斑（senile plaque，SP）沉积、神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）和神经元丢失等是其主要病理表现［1］。AD发病机制目前主要认为与Aβ沉积、tau过度磷酸化、神经炎症及氧化应激等有关。其中Aβ沉积被认为是AD发病的始动因素与重要环节，认为Aβ异常沉积形成的老年斑可诱发tau蛋白异常磷酸化，并造成神经元纤维缠结与突触丢失等级联反应，最终导致神经元凋亡及突出丢失引发临床症状［2-3］。成体哺乳动物脑内被证实存在神经干细胞（neural stem cells，NSCs），促进其增殖、迁移，并且向神经元分化产生神经功能，被认为是修复神经功能损伤的有效途径。然而由于AD病人脑内Aβ的异常沉积造成了大量神经元凋亡及突触丢失，该途径被抑制，因此寻找有效手段促进NSCs增殖并向神经元分化，补充丢失的神经元并恢复神经功能被认为是治疗AD的新希望［4］。NSCs的增殖、分化受机体多条信号转导通路共同调控，其中Janus激酶2∕信号转导和转录激活因子3（JAK2∕STAT3）信号通路在NSCs增殖与分化过程中发挥了重要作用［5］。

牛磺酸是一种游离氨基酸之一，具有保护视力、调节免疫功能、抗氧化、调节糖脂代谢等多种生理作用。此外牛磺酸还具有神经递质、神经营养因子的作用，具有一定的神经保护作用［6］。有研究表明，牛磺酸可促进缺氧缺糖诱导的NSCs向神经元分化［7］。但是其对AD模型NSCs的增殖与分化的影响尚未见报道。因此本研究以Aβ25-35诱导NSCs损伤复制AD-NSCs模型，观察牛磺酸对AD-NSCs的增殖、分化及凋亡的影响，并通过AK2∕STAT3信号通路分析探讨分子机制。

本研究自2019年3月至2019年11月通过Aβ25-35损伤从新生小鼠脑内提取的神经干细胞，建立AD体外模型，探讨牛磺酸和JAK2∕STAT3的作用关系。

1.1 动物C57BL∕6小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量范围22～27 g，8～10周龄，购买于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号SCXK（辽）2019-0001。每只鼠笼内放置1只雄鼠和1只雌鼠，使其自然繁殖。动物实验在辽宁中医药大学实验动物中心实验室饲养，满足实验动物3R原则。本研究符合一般动物实验伦理学原则。小鼠饲养于屏障环境动物设施内饲养，恒温20～25℃，恒湿55%～65%，自由饮用食水。

1.2 实验试剂牛磺酸（美国Sigma公司，批号6730-83-2），NSCs专用培养基（广州赛业生物科技有限公司，批号T202026D501）；
Aβ25-35多肽（北京博奥森生物科技有限公司，货号Y-0044）；
CCK-8试剂盒（北京碧云天生物有限公司，货号C0037）；
EDU试剂盒（Invitrogen公司，货号A10044）；
B细胞淋巴瘤∕白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（caspase-3）及β-肌动蛋白（β-actin）引物购于北京赛诺科为生物科技有限公司；
巢蛋白（Nestin）、胚胎干细胞关键蛋白（Sox-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经元核抗原（NeuN）、少突胶质细胞转录因子2（OLIG-2）、总Janus激酶2（t-JAK2）、总信号转导和转录激活因子3（t-STAT3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、p-STAT3及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号33475S、2748S、80788T、24307S、52635S、3230S、66245S、12640T、9145S、5174S）；
Cy3、FITC标记二抗（美国Jackson公司，货号147259、147301）；
辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（北京中杉金桥生物公司，批号201902433）；
RevertAidTM cDNA合成试剂盒、TRIzolTM试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司，批 号20180914、20170621）；
TransStart®Top Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司，批号2019010123）；
二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒、增强化学发光（ECL）发光试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号P0012S、P0018FS），其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器HCP-168型细胞培养箱（青岛海尔）；
Ti-S型荧光显微镜（日本尼康）；
7500型Real-time PCR仪（美国ABI）；
MR96型酶标仪（深圳迈瑞）；
1645050水平核酸电泳仪、1658001蛋白转膜仪、ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（美国Bio-Rad）。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的分离、培养与鉴定取新生48 h内乳鼠的脑室下区和海马区组织，剪碎、0.25%胰酶消化20 min，加入含10%FBS的培养基终止消化，除去大细胞团，得到细胞悬液，过200目细胞筛网，并接种于24孔板中（接种密度5×109个∕L），置于37℃、5%二氧化碳-95%空气的细胞恒温培养箱中培养。第3天时进行半量换液，细胞逐渐以悬浮的NSCs球形式进行生长。细胞传代至第三代时，利用免疫荧光染色进行鉴定［观察神经巢蛋白（Nestin）、胚胎干细胞关键蛋白（Sox-2）阳性表达情况］。

1.4.2 Aβ23-35寡聚体的制备取Aβ23-351.0 mg溶于六氟异丙醇（HF1P），涡旋后室温下静置直至液体澄清。放入冷冻干燥机内冷冻干燥，得到无色透明的Aβ肽膜。向Aβ肽膜内加入适量DMSO，得到Aβ-DMSO溶液，加入PBS溶液涡旋混匀后置于4℃内孵育24 h，既得到1 mol∕L Aβ23-35寡聚体母液。取适量母液用培养液稀释至25 μmol∕L，备用。

1.4.3 分组与给药实验组分为对照组、模型组（25 μmol∕L Aβ23-35）、Aβ25-35+牛 磺 酸5 mmol组、Aβ25-35+牛磺酸10 mmol组、Aβ25-35+牛磺酸15 mmol组及Aβ25-35+牛磺酸20 mmol组，共六组［7］。药物于Aβ25-35孵育12 h后加入，共同孵育48 h后进行以下指标检测。

1.4.4 CCK-8检测细胞活力将神经球打散，接种于96孔板中，每孔4×105个细胞，继续培养，检测时每孔加入20 μL CCK-8染色液继续培养2 h后，置于酶标仪中，450 nm处测定吸光度（OD）。细胞活力%=（OD实验组∕OD正常组）×100%，实验重复3次。

1.4.5 NSCs增殖能力检测

1.4.5.1 NSCs球半径的测量分别于给药后第3、5、7天，将培养板置于显微镜下，观察NSCs球生长情况，Image J分析软件测量各组神经球的半径，并绘制生长曲线，实验重复3次。

1.4.5.2 EDU增殖检测根据Invitrogen公司ClickiT EDU试剂盒说明书步骤进行荧光染色，荧光显微镜下观察并拍照，利用Image J软件计量增殖阳性细胞数量并计算各组NSCs增殖比率，实验重复3次。

1.4.6 免疫荧光染色检测NSCs分化能力将96孔板中的各组细胞增殖培养液吸出，加入200 μL含有10%FBS和1%P∕S的DMEM∕F12培养液中培养，并相应分为对照组、模型组（25 μmol∕L Aβ23-35）、Aβ25-35+牛磺酸5 mmol组、Aβ25-35+牛磺酸10 mmol组、Aβ25-35+牛磺酸15 mmol组及Aβ25-35+牛磺酸20 mmol组。7 d后，利用免疫荧光细胞化学染色法观察神经元标记物神经元核抗原（NeuN）、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与少突胶质细胞标志物少突胶质细胞转录因子2（OLIG-2）阳性表达，实验重复3次。

1.4.7 Real-time PCR检测凋亡相关基因的表达将打散的单个神经球按每孔5×106∕mL接种于6孔板中，牛磺酸孵育48 h后利用Trizol试剂提取RNA。按照cDNA合成试剂盒说明书反转录得到cDNA。以cDNA为模板，按TransStart Top Green qPCR SuperMix说明书进行体外扩增，各基因引物序列见表1。反应体系（共20 μL）：cDNA 2 μL、Forward Primer（10 μmol）0.4 μL、Reverse Primer（10 μmol）0.4 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、双蒸水7.8 μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环35次；
72℃再延伸1 min。以β-actin作为内参，使用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

表1 基因引物序列

1.4.8 蛋白质印迹法检测JAK2∕STAT3信号通路相关蛋白提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入4倍上样缓冲液，加热变性蛋白，随后进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，加入1∶1 000稀释的t-JAK2、t-STAT3、p-JAK2、p-STAT3及GAPDH工作液，4℃过夜；
加入HRP标记二抗工作液（1∶1 000），孵育1 h，采用ECL发光后显影定影。Image J分析软件被用来进行灰度值分析，结果利用目的蛋白比内参蛋白GAPDH的灰度值表示。

1.5 统计学方法利用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。所有数据以xˉ±s表示，多组之间差异比较采用单因素方差分析，两组间差异比较采用LSDt检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 NSCs的鉴定第3代NSCs生长成细胞球状，并且经过多次传代后形成的NSCs球差异无统计学意义，NSCs球表达神经干细胞标志物Nestin与Sox-2，可用于后续实验。

2.2 牛磺酸对AD-NSCs的活力及增殖能力的影响与对照组相比，模型组NSCs活力降低（P＜0.05）；
而经过不同浓度的牛磺酸孵育后，NSCs活力均有不同程度的升高，其中10 mmol牛磺酸组细胞活力与模型组相比升高最为明显（P＜0.05）；
5 mmol、15 mmol与20 mmol组细胞活力与模型组相比虽显著升高（P＜0.05），但是不及10 mmol牛磺酸明显。通过测量NSCs球半径观察不同浓度牛磺酸对其增殖能力的影响所示，在增殖培养基中加入不同浓度的牛磺酸（5、10、15和20 mmol）后NSCs球半径均有不同程度的增加，各浓度牛磺酸组NSCs球半径从大到小依次为10 mmol＞15 mmol＞5 mmol＞20 mmol。其中，从第5天开始，10 mmol与15 mmol组NSCs球半径与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；
而5 mmol与20 mmol组NSCs球半径与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图1，表2。

表2 牛磺酸对AD-NSCs活力及半径的影响

表2 牛磺酸对AD-NSCs活力及半径的影响

注：①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组5 mmol牛磺酸组10 mmol牛磺酸组15 mmol牛磺酸组20 mmol牛磺酸组F值P值细胞数∕个9 9 9 9 9 9半径∕μm 3 d 70.26±7.11 42.70±3.48①45.28±2.69 43.53±3.79 43.38±3.68 42.65±3.13 70.78 0.068 5 d 86.92±4.21 46.70±2.84 49.73±5.50 53.85±3.31②52.27±3.65②49.09±4.32 125.20 0.003 7 d 111.37±11.98 50.03±5.52 56.73±5.04 67.19±6.34②61.16±5.58②59.09±5.52 87.98 0.003活力∕%100.00 61.25±6.36①74.82±5.14②81.58±7.03②74.32±8.27②69.33±4.36②18.65 0.012

图1 牛磺酸对AD-NSCs半径的影响（×20）

我们进一步利用EDU染色观察了不同浓度牛磺酸对AD-NSCs增殖能力的影响，结果10 mmol与15 mmol牛磺酸组增殖NSCs数量显著增加，与模型组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而5 mmol与20 mmol组增殖NSCs数量与模型组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。

表3 牛磺酸对AD-NSCs增殖能力的影响∕（%

表3 牛磺酸对AD-NSCs增殖能力的影响∕（%

注：①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组5 mmol牛磺酸组10 mmol牛磺酸组15 mmol牛磺酸组20 mmol牛磺酸组F值P值细胞数∕个9 9 9 9 9 9增殖细胞比例78.36±6.72 43.19±3.06①46.95±6.42 56.57±8.11②52.74±7.15②48.57±8.23 10.20 0.005

2.3 牛磺酸促进AD-NSCs向神经元分化NSCs球打散后培养于分化培养基中，并加入不同浓度的牛磺酸（5、10、15和20 mmol）培养7 d后，NSCs分化为不同的神经细胞类型。NSCs分化为3种神经细胞表型，分别为神经元（NeuN+），星形胶质细胞（GFAP+）和少突胶质细胞（OLIG-2+）。经Image J定量分析发现不同浓度的牛磺酸均具有诱导NSCs向神经元分化的能力，其中10 mmol组神经元细胞数量最多，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；
其次为15 mmol组，神经元数量与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。其余两组神经元数量与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。并且牛磺酸10 mmol与15 mmol能显著抑制NSCs向星形胶质细胞分化，星形胶质细胞数量与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组少突胶质细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 牛磺酸对AD-NSCs分化能力的影响∕（%

表4 牛磺酸对AD-NSCs分化能力的影响∕（%

注：NeuN为神经元核抗原，GFAP为胶质纤维酸性蛋白，OLIG-2为少突胶质细胞转录因子2。①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组5 mmol牛磺酸组10 mmol牛磺酸组15 mmol牛磺酸组20 mmol牛磺酸组F值P值细胞数∕个9 9 9 9 9 9 NeuN+22.47±3.63 5.78±1.45①7.93±1.58 12.64±2.12②10.36±1.43②6.68±1.23 26.49 0.003 GFAP+37.74±3.68 65.50±4.58①59.75±6.31 51.49±4.54②54.82±4.59②58.87±7.52 9.59 0.007 OLIG-2+15.39±3.69 17.63±3.18 19.32±5.42 21.38±6.68 18.50±3.62 19.04±2.59 0.70 0.635

2.4 牛磺酸抑制AD-NSCs凋亡相关基因表达与对照组相比，模型组NSCs Bax∕Bcl-2比值显著升高，caspase-3 mRNA表达也显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
而给予不同浓度的牛磺酸共同孵育后，Bax∕Bcl-2比值降低，caspase-3 mRNA表达也降低；
5 mmol、10 mmol和15 mmol牛磺酸组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
而20 mmol牛磺酸组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结合以上实验结果，我们可以初步推测在5～20 mmol范围内，10 mmol牛磺酸对AD-NSCs的保护作用最显著，因此后续机制研究选用10 mmol牛磺酸组作为研究对象。见表5。

表5 牛磺酸对AD-NSCs凋亡相关基因表达的影响∕

表5 牛磺酸对AD-NSCs凋亡相关基因表达的影响∕

注：Bax为B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白，Bcl-2为B细胞淋巴瘤∕白血病-2，caspase-3为胱天蛋白酶-3。①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组5 mmol牛磺酸组10 mmol牛磺酸组15 mmol牛磺酸组20 mmol牛磺酸组F值P值细胞数∕个9 9 9 9 9 9 Bax∕Bcl-2 0.58±0.09 1.35±0.11①0.85±0.05②0.77±0.06②0.81±0.12②1.13±0.08 29.44 0.001 caspase-3 1.04±0.09 1.81±0.12①1.68±0.16②1.49±0.09②1.54±0.06②1.72±0.14 17.10 0.001

2.5 牛磺酸抑制JAK2/STAT3信号通路与对照组相比，模型组NSCs中p-JAK2∕t-JAK2、p-STAT3∕t-STAT3蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
而给予10 mmol牛磺酸孵育后，NSCs中p-JAK2∕t-JAK2、p-STAT3∕t-STAT3蛋 白 表 达 显 著 降低，与模型组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2，表6。

表6 牛磺酸对AD-NSCs中JAK2∕STAT3信号通路活性的影响

表6 牛磺酸对AD-NSCs中JAK2∕STAT3信号通路活性的影响

注：t-JAK2为总Janus激酶2，t-STAT3为总信号转导和转录激活因子3，p-JAK2为磷酸化JAK2，p-STAT3为磷酸化STAT3，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组10 mmol牛磺酸组F值P值细胞数∕个3 3 3 p-JAK2∕t-JAK2 0.79±0.12 1.71±0.09①1.24±0.14②45.24 0.002 p-STAT3∕t-STAT3 1.12±0.10 1.79±0.13①1.36±0.11②20.93 0.003

图2 JAK2∕STAT3信号通路相关蛋白的电泳图

Aβ来自于21号染色体前体APP蛋白，Aβ由APP蛋白经过α-水解酶、β-水解酶和γ-水解酶水解，依次释放Aβ肽和胞内小肽，能引发神经元退变、丢失凋亡等损伤作用。其决定毒性的主要部位在第25-35氨基酸序列，即Aβ25-35，其可通过在神经细胞外蓄积，诱导细胞骨架改变，造成神经损伤。有研究表明，Aβ25-35会导致突触可塑性障碍，从而损伤学习记忆能力［8］。因此Aβ25-35与NSCs共同孵育来建立体外NSCs的AD模型被广泛认可［9］。神经元不具有增殖分裂能力，因此其在发育时期主要由静息的NSCs分化而来［10］。成年哺乳动物NSCs在脑内分布是存在局限的，主要分布于海马齿状回颗粒层下区（subgranular，SGZ）和侧脑室周边的室管膜下区（subventricular zone，SVZ）这两个区域［11-12］。生理状态下，它们处于静息状态，但是在AD等中枢神经系统退行性疾病中它们会代偿性地被激活，并促进其向神经元分化以促进内源性神经再生，弥补缺损的神经组织［13］。然而，由于Aβ沉积可引起线粒体功能障碍而诱导氧化应激，还可触发小胶质细胞活化，诱导神经炎症，导致NSCs向胶质细胞分化，最终导致神经元数量减少［14］。因此寻求一种能够促进NSCs向神经元分化的手段至关重要。

牛磺酸是一种体内含量丰富的非必需氨基酸，在新生哺乳动物中枢神经系统中主要分布于大脑皮层、海马及小脑等区域，且含量较为丰富，但在成年哺乳动物神经系统中牛磺酸的水平非常低［15］。在突触前膜神经元，牛磺酸与牛磺酸受体结合，引起神经元超极化，从而发挥类神经递质样作用。牛磺酸还能够通过抑制神经炎症反应、氧化应激及内质网应激，发挥神经保护的作用。另有研究证明，牛磺酸可减轻神经元损伤，并且能够促进NSCs增殖［16-17］。此外，还有研究表明，牛磺酸可促进脑缺血大鼠NSCs增殖，并促进其向神经元分化［18］，但是对AD模型NSCs的影响，未见报道。本研究结果显示，牛磺酸能够增加AD-NSCs的活力、增强NSCs增殖能力并促进其向神经元分化、还可以死抑制ADNSCs促凋亡基因的表达并增加抗凋亡基因的表达，发挥抗凋亡作用。以上结果说明了牛磺酸可通过促进NSCs增殖、抑制其凋亡，并促进NSCs向神经元分化，促进内源神经再生治疗AD。此外，从本研究实验结果可以看出5 mmol、15 mmol牛磺酸对AD-NSCs的保护作用均弱于10 mmol，且20 mmol牛磺酸显示出了部分细胞毒性。牛磺酸不是蛋白分子，不能通过代谢排出细胞外且降解速率很慢，这可能会造成牛磺酸在细胞内积蓄过多，产生一系列毒性作用，从而导致出现随着浓度的增加，保护作用减弱的现象，但是具体作用机制仍需进一步去验证。

JAK2∕STAT3信号通路在NSCs的增殖与分化过程中起到至关重要的作用，AD状态下释放的炎症因子、神经营养因子会激活JAK2，进而激活STAT3使其发生磷酸化并移位至核内与星形胶质细胞特异性基因GFAP启动子结合，促进NSCs向星形胶质细胞分化［19］。而在机体发育时期，脑内JAK2∕STAT3信号通路活性处于抑制状态，STAT3磷酸化水平低，可促进NSCs向神经元的分化［20］。Wu等［21］发现清脑益智汤可通过抑制JAK2∕STAT3信号通路活性，抑制NSCs向星形胶质细胞的分化。Chen等［22］发现JAK2∕STAT3信号通路参与了妊娠期甲状腺功能亢进症对胚胎NSCs增殖和维持的过程，并且利用超生理剂量的3，5，3"-L-三碘甲状腺原氨酸（T3）可通过抑制JAK2∕STAT3信号通路活性，增强了乳鼠脑内NSCs的维持与向神经元分化的能力。本研究结果发现，AD-NSCs中JAK2∕STAT3信 号 通路 被 激活，JAK2、STAT3磷酸化水平显著升高；
而给予牛磺酸后NSCs中JAK2、STAT3磷酸化水平显著降低，JAK2∕STAT3信号通路被抑制，说明了牛磺酸可通过抑制STAT3磷酸化，继而影响了其与GFAP启动子结合，从而抑制了NSCs向星形胶质细胞的分化，同时促使其向神经元分化。

综上所述，牛磺酸可通过促进AD-NSCs增殖及其向神经元分化，并减少NSCs凋亡，发挥神经保护作用，这种作用在一定程度上可能是通过抑制JAK2∕STAT3信号通路实现的，但是具体作用机制仍需进一步的验证。