外源钙和铜对黑豆芽苗菜生长及生理活性物质的影响

赵文欣，刘凯凯，徐 伟，张慧芋，刘昌斌，马 茹，祁泽伟，张 超，薛建福

（山西农业大学农学院/黄土高原特色作物优质高效生产省部共建协同创新中心/作物生态与旱作栽培生理山西省重点试验室，山西 太谷 030801）

芽苗菜是利用植物种子或营养器官发育成芽、苗、茎的一类新型活体蔬菜[1]。黑豆芽苗菜便是其中一种，也被称为绿色大豆瓣菜，口感清新，外观鲜亮，获得大众消费的喜爱。同时在萌发过程中可有效降解豆类芽苗菜中抗营养因子，使可溶性糖、维生素等多种生物活性成分含量增加，更利于人机体的消化和吸收[2-3]。

目前，关于芽苗菜的研究还主要集中在光质、光周期等因素对其产量和品质的影响上[4]，以提高其经济效益为目的居多，而添加外源微量元素现已成为植物营养改良或富集方面的研究热点[5-9]。世界营养协会规定，成人推荐每日摄入钙含量应为800 mg，儿童推荐每日摄入量应为700～1 300 mg。但从《中国居民营养与健康状况检测》统计的结果来看，我国城市居民每日实际摄入量仅能达到该要求的1/2，随着儿童年龄的增长，对钙元素的摄取也存在明显下降趋势。铜对人体的造血功能有着重要的影响，人体可耐受的铜用量为0.7 mg/d[10]，但调查发现，各年龄段都未及该标准的90%。因此，加强对食物中钙元素和铜元素调控等研究刻不容缓。

本研究通过用不同质量浓度的CaCl2和CuSO4溶液分别对黑豆种子进行浸泡处理，分析黑豆芽苗菜生长特性及生理活性物质的变化情况，以期为提升芽苗菜品质提供一定的理论依据。

1.1 试验材料

试验用晋黑1号由山西省农业科学院选育，挑选色泽光亮、大小一致的种子进行试验。分别以无水氯化钙和无水硫酸钙作为钙源和铜源，将CaCl2和CuSO4这2 种溶液分别用蒸馏水溶解，配制成0.01、0.05、0.2、0.5和1.0 g/L 5个质量浓度的溶液。

1.2 试验设计

本试验于2019 年4 月9 日至4 月18 日在山西农业大学实验室进行，室内平均温度为18.52 ℃。选用CaCl2和CuSO42 种溶液分别进行单因素完全随机区组设计，各设置0（CK）、0.01、0.05、0.2、0.5、1.0 g/L 6个水平，每组50粒种子，设3次重复。

浸泡24 h后取出，换清水浸种数日。将托盘放置于食品级塑料饭盒（25 cm×15 cm×10 cm）中，用透明胶带在距离饭盒底部1/3高度（约3.5 cm）处固定，在托盘中放置双层纯棉纱布，纱布将托盘完全包住并延伸至饭盒底部，饭盒底部添加适量水分微没过纱布，纱布浸入水中保证托盘上始终湿润。种子均匀放于纱布上，且与纱布充分接触，整粒种子表面积的2/3以上接触空气。将整个培养皿置于室温条件下，定期补充水分，保证每个处理处于相同的试验环境。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 苗高、发芽率和发芽势测定 黑豆芽苗菜开始培养后，采用5 点取样法，每天从各处理中随机选取15株芽苗菜，使用刻度尺测定其苗高，分别在第3天和第7天记录数据并计算发芽率和发芽势。

1.3.2 干鲜质量的测定 培养10 d后，选取5株黑豆芽苗菜，用电子天平称量其鲜质量，杀青并烘干后记录其干质量。

1.3.3 生理活性物质的测定 采用紫外吸收法测定可溶性蛋白质含量[11]；
采用分光光度计法测定叶绿素a和叶绿素b含量[12]，利用Arnon公式计算得到叶绿素含量。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016进行数据处理、作图、制表，使用SPSS 25.0对数据进行方差分析，以及使用最小显著差异法（LSD）进行多重比较（P＜0.05）。

2.1 不同质量浓度CuSO4和CaCl2溶液对黑豆芽苗菜发芽特性的影响

试验前期（第1、2 天）CuSO4溶液质量浓度为0.01 g/L 时，芽苗菜苗高较CK 分别增长14.40%和7.22%，而经不同质量浓度CuSO4溶液处理5 d后的黑豆芽苗菜苗高较CK 均受到抑制，抑制率在10.00%～60.30%（图1）。经质量浓度0.01、0.05 g/L的CaCl2溶液浸种处理后，黑豆芽苗菜苗高较CK分别增加0.85%和2.50%，而质量浓度在0.2、0.5、1.0 g/L 处理的抑制率分别为7.84%、13.72% 和15.58%。

从图2 可以看出，经不同质量浓度CuSO4溶液浸种处理后，黑豆种子发芽势为29.00%～66.67%，发芽率为89.33%～98.67%。在0.01、0.5 和1.0 g/L质量浓度下的发芽势较CK 分别显著降低13.00%、32.50%和56.50%（P＜0.05），在0.05 和0.2 g/L 质量浓度下与CK 无显著差异。此外，0.2 g/L 质量浓度下发芽势较0.5 和1.0 g/L 处理分别显著提高了25%和51.67%（P＜0.05）。1.0 g/L 处理下的黑豆种子发芽率较其他处理显著降低了6.95%～9.47%（P＜0.05），其他处理与CK 相比发芽率无显著差异。

从图2可以看出，经不同质量浓度CaCl2溶液处理后，黑豆芽苗菜发芽势为53.33%～66.67%，发芽率为97.33%～99.33%。在1.0 g/L 处理下，黑豆种子发芽势较CK、0.01、0.05、0.2、0.5 g/L 处理显著降低13.04%～20.01%（P＜0.05），其他处理间黑豆芽苗菜发芽势无显著差异。不同质量浓度CaCl2溶液处理对黑豆种子发芽率均无显著影响。

2.2 不同质量浓度CaCl2与CuSO4溶液对黑豆芽苗菜干鲜质量的影响

由图3 可知，不同质量浓度CuSO4溶液浸种处理下，黑豆芽苗菜的鲜质量、干质量间无显著差异。CaCl2溶液在0.05 g/L 质量浓度下黑豆芽苗菜的鲜质量较0.2、0.5 g/L 处理分别显著提高了9.29%和12.57%（P＜0.05），0.5 g/L 处理较CK、0.01、0.05、1.0 g/L 处理显著降低8.57%～12.57%（P＜0.05），0.2、0.5 g/L处理间与CK、0.01、0.05、1.00 g/L处理间均无显著性差异。当CaCl2溶液在0.2 g/L质量浓度下黑豆芽苗菜干质量较CK 显著降低了12.28%（P＜0.05），0.05 g/L处理下黑豆芽苗菜的干质量与其他各处理间均无显著差异。

2.3 不同质量浓度CuSO4和CaCl2溶液对黑豆芽苗菜生理活性物质的影响

随着CuSO4处理质量浓度的升高，黑豆芽苗菜中可溶性蛋白含量呈现逐渐增加的趋势，1.0 g/L浸种处理后，较CK、0.01、0.05、0.2、0.5g/L 处理显著增加9.58%～19.54%（P＜0.05），0.05 g/L 处理与CK、0.01、0.2和0.5 g/L处理间均无显著差异。不同质量浓度CaCl2溶液处理下的可溶性蛋白含量与CK 间均无显著差异，且各溶液处理间差异不显著（图4）。

由图5 可知，在0.01 g/LCuSO4溶液处理下叶绿素a 含量较CK 显著降低32.41%（P＜0.05），且除CK之外，其余各处理间均无显著差异。0.05 g/L处理下的叶绿素b 含量较CK 显著提高58.91%（P＜0.05），除CK 之外，其余处理间无显著差异。叶绿素含量表现为随CuSO4溶液质量浓度增加呈先增加后降低的趋势，且在0.05 g/L处理时达到最大，黑豆芽苗菜叶绿素含量较CK、0.2、0.5 和1.0 g/L 处理显著增加9.38%～22.19%（P＜0.05），0.01、0.05 g/L处理间无显著差异。

由图5可知，经CaCl2溶液浸种处理后，在0.2 g/L处理下黑豆芽苗菜叶绿素a含量较CK、0.5和1.0 g/L处理显著降低了26.94%～45.09%（P＜0.05），除该处理外，其他处理间均无显著差异。不同CaCl2溶液处理后的叶绿素b 含量与CK 无显著差异，且各处理间差异也不显著。叶绿素含量随CaCl2溶液质量浓度增加表现为先降低后增加的趋势，在0.2 g/L处理下，黑豆芽苗菜叶绿素含量较CK、0.5 和1.0 g/L 处理显著降低22.97%～24.31%（P＜0.05），除该处理外，其他处理间均无显著差异。

3.1 不同质量浓度CuSO4溶液浸泡对黑豆芽苗菜生长的影响

Cu2+在适当浓度下可起到富集营养的作用，但含量过高则会导致植物体内代谢紊乱[13]。在赵玉红等[14]的试验中，经不同Cu2（+100～500 mg/L）处理后种子苗长均受到抑制，较低Cu2+质量浓度（100～300 mg/L）对红豆草、白三叶种子的发芽率、发芽势表现为促进效果，较高质量浓度（400～500 mg/L）表现出强烈的抑制作用，与本试验研究结果一致。本试验Cu2+的研究结果与鱼小军等[15]在Cu2+（200～500 mg/L）下对毛苕子、红三叶和苜蓿等植物种子的发芽率、芽长均呈不同程度降低的影响趋势相同。不同植物对Cu2+浓度耐受能力不同，抑制植物生长的原因可能是由于过量的Cu2+渗入使细胞膜的强度下降，产生生理毒害作用，进而影响芽苗菜生长[16-17]。

鲜质量体现了植株在自然生长下的状态，干质量可以反映根的活力、质量以及干物质的积累量。杨丽丽[18]采用不同浓度Cu2（+0.3～1 000 μmol/L）对甜叶菜浸泡后，茎和根的干、鲜质量含量均随着Cu2+浓度升高而下降。本研究经Cu2+处理后，发现干质量、鲜质量在0.01～1 g/L 范围内无显著差异，但呈现下降趋势，可见黑豆芽苗菜干鲜质量对Cu2+的耐受能力在该范围内。

3.2 不同质量浓度CaCl2浸泡对黑豆芽苗菜生长的影响

Ca2+可以保证细胞膜结构的稳定性，特别是在环境胁迫条件下，增强植物的抗逆性[19]，但过高浓度的钙离子会降低植物硼、锌等微量营养元素的有效性，阻碍磷的代谢进程，从而抑制植物生长[20]。刘志敏[21]选用不同浓度钙离子对花心萝卜种子进行处理，发现经最适生长浓度（0～4 mmol/L）浸泡后，高浓度（5～8 mmol/L）对芽苗生长抑制，苗长均呈现低促高抑的趋势。张毅功等[22]选用不同质量浓度Ca2（+0～160 mg/L）对苹果苗的鲜质量、干质量进行研究，结果表明，当Ca2+在0～40 mg/L 时，苹果茎、叶和根的干、鲜质量达到最大，而过高质量浓度（160 mg/L）Ca2+对苹果各部位均造成生理毒害作用。本试验CaCl2溶液在较低质量浓度（0.01～0.05 g/L）下促进苗高生长，而0.2～1.0 g/L 下抑制生长。同时，黑豆芽苗菜鲜质量、干质量分别在0.5、0.2 g/L质量浓度显著下降，而在0.01～0.2 g/L和0.01～0.05 g/L范围并未有显著变化，这可能是由于不同植物对Ca2+的敏感性不同导致，后期可适当增大试验浓度梯度来进一步分析。

3.3 不同质量浓度CuSO4浸泡对黑豆芽苗菜生理活性物质的影响

可溶性蛋白常用作筛选抗性的指标之一，它能提高细胞的保水能力，通常作为衡量是否发生重金属胁迫的重要标志[23]。王芳洲等[24]将秋茄作为研究对象，探究不同质量浓度（0～45 mg/L）Cu2+对其可溶性蛋白含量变化的影响，结果表明，在0～15 mg/L Cu2+下，可溶性蛋白含量呈现上升趋势，随即在30～45 mg/L 下可溶性蛋白含量下降。本试验在1.0 g/L CuSO4处理下可溶性蛋白显著增加并未出现下降趋势，可见黑豆芽苗菜对Cu2+的耐受程度较强。今后可增加试验浓度梯度，对黑豆芽苗菜可溶性蛋白的耐受峰值做进一步研究。测定叶绿素含量能够确定植物的光合作用能力，叶绿素含量与施浩威[25]采用Cu2（+0～900 mg/kg）胁迫芳樟叶片处理后叶绿素含量变化趋势和范围（0～50 mg/kg）相同。

3.4 不同质量浓度CaCl2浸泡对黑豆芽苗菜生理活性的影响

谢元贵等[26]采用不同浓度（0～50 mmol/L）Ca2+溶液对金银花叶片浸泡后，结果表明，可溶性蛋白含量均小于CK（0 mmol/L）。而本试验Ca2+在0.01～1 g/L 范围内较CK 变化不显著，可见较低质量浓度Ca2+对黑豆芽苗菜影响不明显。

PAL等[27]选用不同浓度的Ca2+溶液对花生和亚麻籽粒进行喷施，结果表明，高浓度Ca2+（0.003～0.1 mol/L）或低浓度Ca2（+0～0.003 mol/L）都会使叶绿素含量降低。本试验中在0.2 g/L CaCl2处理下可溶性蛋白较CK 显著降低，随后较之显著增加，其原因是由于在营养液的离子组成中，Ca2+缺乏可能对特定的代谢过程产生抑制作用，同时镁作为叶绿素的中心原子[28]，高钙环境下抑制了镁的吸收。今后可增加Ca2+浓度进一步研究。

本试验选用2种溶液对黑豆种子分别浸泡，而未考虑两者间交互作用的影响，有关黑豆品种，Ca2+、Cu2+浓度及培养条件等因素对各项指标的影响有待进一步探究。

当Cu2+质量浓度在1.0 g/L 时黑豆芽苗菜的可溶性蛋白含量显著增加，但超过该质量浓度叶绿素含量、发芽率、发芽势显著降低，且抑制苗高；
较低质量浓度（0.01～0.5 g/L）Cu2+浸泡后的黑豆芽苗菜的可溶性蛋白含量间无显著差异，不同Cu2（+0.01～1 g/L）处理对干鲜质量影响较小，在0.05 g/L处理下芽苗菜苗长影响不大且叶绿素含量显著增加。

较高质量浓度（1.0 g/L）Ca2+处理后黑豆芽苗菜发芽势显著降低，苗高受到抑制，0.2 g/L 处理下叶绿素含量和干质量显著降低；
低质量浓度（0.01～0.05 g/L）CaCl2溶液浸泡对黑豆芽苗菜苗长起到促进作用，且发芽率无显著差异，但可溶性蛋白含量增加。

综合来看，Cu2+、Ca2+质量浓度在0.05 g/L 条件下，黑豆芽苗菜生长较好。