[己烯雌酚对体外培养正常人表皮黑素细胞的作用]工作细胞动漫

　　[摘要]目的:观察不同浓度外源性雌激素己烯雌酚（Diaethylstilbestro，DES）对体外培养人正常黑素细胞的细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响。方法:采用MTT法测定黑素细胞增殖情况，参考Nakajima M方法测定酪氨酸酶活性。结果:不同浓度己烯雌酚对体外培养人黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性均有促进作用。结论:己烯雌酚能促进人黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性，对相关皮肤色素性疾病可能有一定的治疗作用。
　　[关键词]己烯雌酚；黑素细胞；酪氨酸酶
　　[中图分类号]R329.25[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-03
　　
　　Effects of Diaethylstilbestro（DES） on cultured human melanocytes in vitro
　　GONG Shi1, ZHANG Qing2, ZHAO Zhi-Guo2,lIU Qiao 1,CHENG Yong-jun1,WANG Ai-min1,YANGXian-xiu1 ,CHEN Kang1
　　(1.Department of Dermatology,Hai nan Provincial Skin Disease Hospital,Haikou, 570206 Hainan,China; 2.Department of Pharmacology, Guiyang Medical College)
　　
　　Abstract: ObjectiveEstablishing the culture of human normal melanocytes in vitro,and studying the effects ofDiaethylstilbestro（DES） on cultured human melanocytes. MethodsViability of melanocytes were measured by MTT method;tyrosinase activity was measured by utilization of L-Dopa as the substrate(Nakajima M.method ). ResultsDifferent dosage ofDiaethylstilbestro（DES）induced a strong promotion on melanocytic viability and tyrosinase activity. Conclusion Diaethylstilbestro（DES）can promote melanocytic proliferation and tyrosinase activity. Diaethylstilbestro might have some therapentical effects on correlated pigmented skin diseases.
　　Key words: Diaethylstilbestro（DES）; Melanocytes ;Tyrosinase
　　
　　早期研究观察到外源性雌激素局部和系统使用均能引起人类皮肤色素沉着。SD-McLeod等[1]早在1994年就证实内源性雌激素能促进体外培养人表皮黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性，最近的细胞免疫化学研究也证明了成人包皮来源体外培养的黑素细胞可表达雌激素受体[2]。多年来，雌激素对人表皮黑素细胞作用的研究主要是围扰内源性雌激素，且随着雌激素皮肤受体的精确定位，逐步证实大部分与雌激素受体结合的配基（包括外源性雌激素）有很相似的结合构象。另有报道称人工合成的己烯雌酚（Diaethylstilbestro，DES）极易与体内雌激素受体蛋白结合，具有比天然雌激素更强的基因表达[3]。因此本实验利用体外培养的正常人表皮黑素细胞，研究了外源性雌激素―己烯雌酚对体外培养人黑素细胞的增殖及酪氨酸酶活性的影响，拟证实外源性雌激素（DES）的活性，为进一步理解内、外源性雌激素活性异常所造成的皮肤病理过程提供参考。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1试剂：己烯雌酚1ml：2mg（针剂规格，上海通用药业股份有限公司，批号：H31021403），黑素细胞培养液（美国Cascade公司产品），DispaseⅡ酶（瑞士Roche公司产品，购自第三军医大学），左旋多巴（L-dopa，Sigma公司产品），噻唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO），TritonX-100（购Sigma公司）。
　　1.2 仪器：OLYMPUS倒置显微镜(CK40),Thermo-forma CO2孵箱，Eppendorf-5810R低温离心机，美国Bio-tck酶标仪（ELX800）等。
　　1.3 药物制备[1，4-5]:将己烯雌酚注射液在无菌条件下用黑素细胞基础培养基倍比稀释成以下浓度：10-4M，10-6M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M 。其中，10-9 ～10-11M为人体内源性雌激素生理浓度，M=mol/L，4℃避光保存备用。
　　1.4正常人黑素细胞的培养及传代[6-7]：取3～20岁正常人包皮环切标本，生理盐水反复多次冲洗，去除皮下组织，切成3mm×5mm的小条，DispaseⅡ酶4℃消化15h后，仔细分离表皮和真皮，取表皮剪碎，0.25%胰酶37℃消化20min，终止消化后吹打成单细胞悬液，筛网过滤后离心，以5×106/ml接种于含黑素细胞培养液的培养瓶中。置入CO2孵箱中37℃培养，24h后首次换液以去除未贴壁细胞，然后按情况进行换液。原代接近融合时，胰酶消化传代，实验选用2～4代细胞。
　　1.5 黑素细胞鉴定[8-9]：收集第二代细胞进行HE染色和脱色素HE染色及多巴，S-100免疫组化染色（一抗为小鼠抗人S-100蛋白抗体）鉴定。
　　1.6 MTT法测定不同浓度外源性雌激素对黑素细胞增殖的影响：MTT 法实验操作用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法。选择对数生长期MC,胰酶消化后，调整细胞浓度为5×104/ml接种于96孔培养板,常规孵育,细胞贴壁后12h弃上清→分别加入不同浓度己烯雌酚液20uL/孔，培养液180 uL/孔，继续MC细胞培养。该项实验以无药培养液换液做对照（200uL/孔），每一浓度设4个重复孔→ 观察72h分别加入MTT 20ul/孔,继续孵育4h后弃上清，加二甲基亚砜(DMSO)200uL/孔,振荡10min,置酶标仪上测定吸光度值，激发波长为570nm处，参考波长为630nm测OD值。计算MC增长率(%)=(A各浓度/A正常-1)×100% 。
　　1.7 酪氨酸酶活性测定[10]：细胞接种方法同上,药物作用3 天后,弃去上清液,0.01mol/L的PBS 洗2 次,每孔加90μl 10ml/L 的TritonX-100,震荡5min 以溶解细胞,每孔再加10μl 质量分数为0.1 %的左旋多巴溶液,37℃孵育30min,振摇后在高通量多功能微板测试系统490nm 波长处比色。酪氨酸酶活性增殖率=[1-(各浓度平均吸光度值- 空白孔平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值- 空白孔平均吸光度值)]×100%。
　　1.8统计学处理：采用SPSS软件进行单因素方差分析,P＜0.05为有显著性意义。
　　
　　2结果
　　
　　2.1形态学结果：体外培养的正常人黑素细胞为树突状细胞,有较多树突,胞体内可见黑素颗粒,细胞增殖良好,连接成网。细胞铺满培养瓶后进行传代培养,约7～10天传一代(见图1)。
　　2.2黑素细胞鉴定：HE染色，黑素细胞呈梭形，有2～3个树突，核蓝紫色，胞浆呈粉红色(见图3)；脱黑素HE染色，胞浆呈蓝色，树突呈淡蓝色，细胞内色素颗粒全部脱去(见图4)；Dopa染色，可见细胞浆内阳性着色(黑色或灰色)(见图5)；S-100蛋白染色阳性，细胞浆呈棕黄色染色,从而可以鉴定为黑素细胞(见图6)
　　
　　2.3不同浓度外源性雌激素（DES）对人正常皮肤黑素细胞增殖率(%)的影响：由表1可见,10-4～10-11mol/L的己烯雌酚（DES）均对人正常皮肤黑素细胞具有不同程度的促增殖作用，其中10-8mol/L浓度的DES对黑素细胞促增殖活性最明显(增殖率为88.9%)；从10-9mol/L浓度到10-11mol/L浓度，增殖率开始依次下降。不同浓度外源性DES孵育的黑素细胞于72h经方差分析表明：各浓度组与空白对照组相比较, 10-4mol/L浓度组，10-6 mol/L浓度组和10-11mol/L浓度组差异无显著性（P＞0.05）；10-9mol/L浓度组和10-10mol/L浓度组与空白对照组相比较,差异有显著性（P＜0.05）；10-8mol/L浓度组与空白对照组相比较，差异亦有显著性（P＜0.01），证实10-8mol/L浓度组，10-9mol/L浓度组和10-10mol/L浓度组均可促进黑素细胞增殖。
　　2.4 不同浓度外源性雌激素（DES）对人正常皮肤黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：表2显示，不同浓度外源性雌激素（DES）对体外培养人正常皮肤黑素细胞酪氨酸酶活性有剂量依赖性： 10-4～10-8mol/L的己烯雌酚（DES）作用逐渐增高，10-8 mol/L作用最强（97.5%），这一结果与MTT检测结果很相似；但是，10-10mol/L时，作用微弱（19.5%），10-11mol/L则几乎无明显影响(4.9%)。经方差分析表明：各浓度组与空白对照组相比较,10-4 mol/L浓度组，10-6 mol/L浓度组和10-11mol/L浓度组差异无显著性（P＞0.05）；10-10mol/L浓度组和10-9mol/L浓度组与空白对照组相比较,差异有显著性（P＜0.05）；10-8 mol/L浓度组与空白对照组相比较,差异也有显著性（P＜0.01），证实10-8mol/L浓度组、10-9mol/L浓度组和10-10mol/L浓度组均可增强黑素细胞酪氨酸酶活性。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　早期的研究已经观察到雌激素能引起人类皮肤色素沉着，如：服用含雌激素口服避孕药后，部分女性面部可能会出现色素沉着，且局部应用含雌激素的软膏也会引起局部色素沉着。这些是比较常见的外源性雌激素引起的色素沉着，它极大的影响人们的美观[11]。
　　雌激素对皮肤不同类型细胞，诸如表皮角质形成细胞，真皮成纤维细胞以及黑素细胞，都有着显著效应。它也关系到毛囊、皮脂腺、顶泌汗腺等附属器官的调节功能，对皮肤老化、色素形成、毛发生长、皮脂分泌乃至皮肤肿瘤都有显著调节作用[12]。外源性雌激素在结构或功能上与内源性雌激素很相似，可模拟或干扰内源性雌激素功能，与人体各脏器雌激素受体结合后发挥广泛作用。己烯雌酚是人工合成雌激素，与天然雌二醇结构相似，它目前仍是临床常用药物。本研究以人体生理雌二醇浓度为参考，设计不同浓度组的外源性己烯雌酚，利用MTT比色方法和Boyd MR等的方法分别检测不同浓度外源性DES对体外培养人正常黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响。结果显示：不同浓度外源性DES对黑素细胞增殖均有活性，其中，10-8mol/L浓度和高效剂量组作用最强；同时，对黑素细胞酪氨酸酶活性影响特点如下：外源性DES在10-4～10-8mol/L浓度，作用逐渐增高，其中，10-8 mol/L作用最强；但10-10mol/L时，作用微弱（2.17%），10-11 mol/L则无明显影响。这一结果与内源性雌激素对体外培养黑素细胞增殖作用的现有研究报道基本吻合。由于MC增殖和其活性增强对临床皮肤脱色后复色起决定作用，研究结果表明一定的临床药物剂量调整，可能会避免或减少色素沉着的发生。
　　总之，通过本实验，使内、外源性雌激素对人体皮肤色素形成的作用研究进一步扩大，也增加了它的皮肤临床应用前景。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2008-03-11[修回日期]2008-05-05
　　编辑/李阳利