对于体外培养的人二倍成纤维细胞【强脉冲光对培养的人成纤维细胞表达ＭＭＰ－１和ＴＩＭＰ－１的影响】

　　[摘要]目的：观察强脉冲光照射对体外培养的成纤维细胞表达基质金属蛋白酶(MMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的影响，探讨IPL嫩肤作用的分子生物学机制。方法：采用能量密度分别为20、25、30J/cm2的强脉冲光对培养的人成纤维细胞进行照射，于照射后24h及48h应用ELISA法测定上清液中MMP-1和TIMP-1的表达并与对照组比较。结果：照射24h后25及30J/cm2组上清液中检测到的MMP-1、TIMP-1含量轻度升高；48h时各能量组MMP-1均升高，但各组间并无显著性差异。TIMP-1随能量的升高而含量增高。结论：强脉冲光照射成纤维细胞后可引起MMP-1，TIMP-1表达的增加，但是TIMP-1的增加远远大于MMP-1的增加，提示IPL嫩肤作用的生物学机制可能与成纤维细胞产生的TIMP-1增加有关。
　　[关键词]强脉冲光；成纤维细胞；MMP-1；TIMP-1
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0885－03
　　
　　细胞外基质(extracellular mattix，ECM)在维持正常组织与功能及细胞生长、分化过程中起着非常蓖要的作用，它处于不断新陈代谢、降解重塑的动态平衡中。基质金属蛋白酶(matrix metal－loproteiEases，MMP)是降解ECM的重要酶类，几乎能降解细胞外基质的所有成分。而组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metallopro－teiEase，TIMP)是MMP的天然抑制物，是一组能抑制MMP活性的多功能因子。MMP和TIMP之间的平衡关系在调节ECM的稳定中有重要作用。
　　临床实践证明强脉冲光(IPL)可有效改善面部皮肤光老化，但生物学机制尚不完全清楚。据文献报道IPL通过光热解效应对组织产生一定程度热损伤而启动损伤修复机制达到组织重塑的目的，但在对组织修复机制的研究中，MMP-1和TIMP-1在其中作用的研究报道少见。据此，本实验观察IPL作用于培养的人成纤维细胞后，上清液中表达MMP-1和TIMP-l动态变化的影响，从蛋白水平研究IPL在治疗皮肤光老化过程中MMP-1和TIMP-l所起的作用，以探讨强脉冲光(IPL)治疗作用的生物学机制。
　　
　　1
　　材料和方法
　　
　　1．1　试验仪器：IPL Quantum SR光子嫩肤仪(Lume－nis公司)，台式高速离心机，恒温水浴箱，酶标仪(美国450型酶联检测仪)。
　　
　　1．2　细胞准备及实验分组
　　1．2．1　成纤维细胞培养：取正常儿童包皮组织，应用组织块贴壁法原代培养，培养成功后传代培养，试验时用第三代至第五代细胞。
　　1．2．2　实验分组
　　1．2．2．1　实验分组：对照组为空白，实验组照射参数参照临床常用治疗参数，即波长选择为560－1200nm脉冲类型为双脉冲，脉宽为34ms(第一子脉冲3.0ms，延迟25ms，第二脉冲6.0ms)，分为三组，能量密度分别为20J/cm2，25j/cm2，30J/cm2。
　　1．2．2．2　样品准备：①每孔2×105个细胞接种于3.5cm培养板中，细胞生长至亚融合时给予IPL照射。将亚融合状态的培养细胞分为照光组(6个)和对照组(1个)，每次共7皿，实验独立重复4次。照射前细胞用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)换液，使PBS刚好覆盖细胞，室内消毒1h，枪头用75％酒精擦拭，采用Quantum SR光子嫩肤仪，每个培养皿照射5次， 能量密度分别为20j/cm2，25J/cm2，30j/cm2，每组能量两个培养皿。照射后弃去覆盖液PBS，在成纤维细胞中加入DMEM培养基，并全部放回孵箱继续培养，对照组除未给予IPL照射外，其余与照光组处理相同。②24h及48h后分别收集培养液的上清液置Ep管中，放置于-20℃冰箱冷藏备用。
　　
　　1．3　上清液中MMP-1和TIMP-1的检测：采用双抗体夹心ABC－ELISA法，在492nm处测OD值，MMP－1浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中MMP-1浓度。人TIMP-1酶联免疫测定步骤及结果判断同上。
　　
　　1．4　统计学处理：数据采用x ±s表示，采用SPSS10.0统计软件对数据进行单因素方差分析，q检验及t检验，P＜0.05为有统计学差异。
　　
　　2　结果
　　
　　在体外培养的成纤维细胞分别用20J/cm2，25J/cm2，30J/cm2IPL照射，24h及48h后上清液检测MMP-1和TIMP-1表达。
　　
　　2．1　IPL照射后体外培养的成纤维细胞上清液检测MMP-1：在培养24h后上清液检测MMP-1，与对照相比检测到的MMP-1在20J/cm2组没有变化，25j/cm2，30j/cm2组MMP-1含量升高。方差分析显示，F=5.812，P＜0.05，q检验显示，24h－MMP对照组1与2，2与3，3与4之间相比无显著性差异(P＞0.05)，余各组相比均有显著性差异(P＜0.05)。培养48h后上清液检测MMP-1，与对照相比上清液中检测到的各组MMP-1含量均增高，但MMP-1并不随照射能量增加而升高。方差分析显示，F＝10.614，P＜0.01，q检验显示，48h-MMP时2与3，2与4，3与4之间相比无显著性差异(P＞0.01)，余各组相比均有显著性差异(P＜O.01)。

　　
　　2．2　IPL照射后体外培养的成纤维细胞上清液检测TIMP-1：培养24h后上清液检测TIMP-1，与对照相比上清液中检测到的TIMP-1在20J/cm2亦无变化，而25J/cm2，30J/cm2组TIMP-1含量升高。方差分析显示，F＝8.074，P＜0.01；q检验显示，24h-TIMP时对照组1与2，2与3，3与4之间相比无显著性差异(P＞0.01)，余各组相比均有显著性差异(P＜0.01)。培养48h后上清液检测TIMP-1，与对照组相比上清液中检测到的TIMP-1随能量增加，而TIMP-1含量升高。方差分析显示，F＝259.464，P(0.01；q检验显示，48h－TIMP时各组相比均有显著性差异(P＜0.01)。

　　2．3　各能量组不同时间之间MMP-1与TIMP-1含 量的t检验：各能量组之间MMP-1含量的变化并不随时间推移而增加。各能量组之间TIMP-1含量的变化随时间推移而明显增加。
　　
　　3　讨论
　　
　　强脉冲光(IPL)技术是近年来发展起来的治疗皮肤光老化的一种新方法，其波长为＞500nm的非相干红光和红外光，因此可以透过表皮穿透到真皮和皮下组织。临床实践已证实能有效改善皮肤色素增加性病变和血管性增生性病变，同时能改善皮肤的质地、细小皱纹。Negishi等对治疗后患者皮肤行免疫组化研究发现，强脉冲光不仅增加Ⅰ型胶原合成，而且也增加Ⅲ型胶原合成。Raulin等认为，IPL通过选择性光热解作用，导致胶原损伤，启动损伤修复过程使胶原含量增加。近年来在研究有关ECM合成和降解的代谢平衡调解中，MMP和TIMP两个酶系统的作用引人注目。现已经发现26种MMP，称为MMP家族。MMP能通过破坏基质的降解平衡而促进肿瘤细胞突破基底膜和细胞外基质构成的组织屏障作用，从而侵袭周围组织。MMP的表达在未受刺激的细胞中较低，但是部分在各种细胞外刺激因素诱导下(包括生长因子，细胞因子肿瘤促进剂，紫外线和红外线辐射)，含量升高。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metal-loproteinase，TIMP)是MMP的天然抑制物，是一组能抑制MMP活性的多功能因子。TIMP是阻断ECM降解，抑制MMP活性的一组分泌糖蛋白，它参与组织结构的建立与维持，可间接影响依赖ECM进行的细胞信号传递，现已发现TIMP有4个家庭成员。TIMP-1可由多种细胞分泌，它可优先抑制MMP-1。
　　目前有关IPL引起皮肤热损伤修复机制的研究中，对MMP和TIMP的作用研究报道较少。王明利等曾观察过强脉冲光(IPL)对大鼠皮肤MMP-1和TIMP-1表达的影响，结果在照射大鼠皮肤后，第1天MMP-1即见表达，第7天表达至高峰，第15天表达开始减弱，而第1天TIMP-1无表达，第3天出现表达并逐渐增强，第15天时达到高峰。本实验显示，亚融合状态的成纤维细胞在分别接受20J/cm2、25J/cm2、30J/cm2强脉冲光照射后，在培养24h后20J/cm2组上清液未检测MMP-1及TIMP-1变化，而25J/cm2、30J/cm2组MMP-1和TIMP-l含量轻度升高。在培养48h后则各能量组MMP-1均增高，但并不随照射能量增加而升高。然而，在培养48h后发现TIMP-1随IPL照射能量增加而含量升高，并且各组相比均有显著性差异，表明在IPL照射后早期MMP-1和TIMP-1二者升高幅度无差别，而照射后48h则各能量组TIMP-1均明显较MMP-l含量增高。这一结果与王明利等的研究结果有一定差异，可能是因为作用的对象以及检测的方法和时间不同而有差异。
　　基于TIMP的功能，本实验结果表明IPL对组织热损伤的修复和重塑作用在照射后48h开始启动并与照射能量成正相关，提示IPL嫩肤作用的生物学机制可能与成纤维细胞产生的TIMP-1增加有关。