利用高效液相色谱法测定山西中条山五味子2种有机酸的含量

张彩红，史 鹏，杨延青，常茂林

(山西省林业和草原科学研究院，山西 太原 030012)

五味子为常用中药材，对失眠、多汗、腹泻、疲劳、神经衰弱等疾病具有一定的治疗效果[1,2]。有研究表明，五味子中含有丰富的有机酸，包括柠檬酸、苹果酸[3]等。山西中条山太宽河保护区分布的野生五味子资源丰富，笔者通过高效液相色谱法测定其果实中有机酸的含量，以期为促进山西省野生五味子资源的合理开发和利用提供理论支持。

1.1 材料

试验材料为山西中条山太宽河保护区内分布的野生五味子果实，选择6个不同产地的优树果实，分别标记为sj-001、sj-002、sj-003、sj-004、sj-005、sj-006。

1.2 试剂

试验试剂包括柠檬酸标品(中国食品药品检定研究院)、L-苹果酸标品(中国食品药品检定研究院)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、H3PO4(分析纯)、HCl(分析纯)、无水乙醇(分析纯)。试验用水为经超纯水机处理的一级水。

1.3 仪器

试验仪器包括Aglient 1260 Ⅱ高效液相色谱仪(DAD检测器)，美国安捷伦公司；
混匀振荡器，Heidolph公司；
超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；
超纯水机(Milli-Q)，Millipore公司；
电子天平(精度0.000 1 g)，赛多利斯公司。

2.1 液相色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18(150.0 mm×4.6 mm，5 μm)，美国安捷伦公司。流动相A为乙腈溶液，流动相B为0.2%的H3PO4溶液，梯度洗脱15%～60% A(0 min～25 min)、15% A(30 min)。流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃。紫外检测器检测波长为220 nm。

2.2 标准储备液的制备

准确称取L-苹果酸标品、柠檬酸标品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到10 mg/mL的储备液，于4 ℃下避光保存。取适量储备液，置于10 mL容量瓶中，用流动相(A∶B=15∶85)稀释至刻度，摇匀。逐级稀释成系不同浓度的对照品。

2.3 供试溶液的制备

将五味子样品烘干、粉碎、过筛后备用。准确称取1.000 0 g的五味子样品于三角瓶中，加入20 mL提取剂(甲醇和H2O的体积比为60∶40)，超声振荡提取30 min，离心，收集残渣进行再提取。取出提取液冷却至室温，混合2次提取液,定容至50 mL，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，待上机。

2.4 方法学验证

1)系统适用性试验。精密吸取10 μL混合对照品溶液，按2.1项的色谱条件进行测定，记录色谱图。

2)线性关系考察。配置50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL、500 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL的混合对照品溶液，按2.1项的色谱条件进行测定，以峰面积为Y，对照品溶液浓度为X，进行回归分析。

3)精密度试验。精密吸取同一浓度的对照品溶液，按2.1项的色谱条件，连续进样测定5次，分别计算2种有机酸的峰面积RSD。

4)重复性试验。精密称取同一五味子样品5份，按2.3项的方法制备供试溶液，按2.1项的色谱条件进行测定，分别计算2种有机酸的峰面积RSD。

5)稳定性试验。精密称取同一五味子样品1.000 0 g，按2.3项的方法制备供试溶液，按2.1项的色谱条件进行测定，每8 h进样1次，共测定5次，分别计算2种有机酸的峰面积RSD。

6)加样回收率试验。精密称取5份1.000 0 g的五味子样品，按照2.3项的方法制备供试溶液，按2.1项的色谱条件进行测定，分别计算2种有机酸的加样回收率和RSD。

2.5 五味子有机酸含量的测定

将6个产地的五味子样品分别按2.3项的方法制备供试溶液，再按2.1项的色谱条件进样10 μL，采集色谱图。根据色谱图中待测成分的峰面积计算6个供试品中的有机酸含量。

3.1 方法学验证结果

1)系统适用性。对照品溶液的L-苹果酸和柠檬酸HPLC图谱见图1和图2。

图1 对照品溶液的L-苹果酸HPLC图谱

图2 对照品溶液的柠檬酸HPLC图谱

由图1和图2可知，混合对照品溶液中L-苹果酸和柠檬酸的分离度均大于1.5，系统适用性良好。

2)线性关系。2种有机酸的线性回归方程、相关系数(R2)与线性范围见表1。

表1 线性关系考察结果

由表1可以看出，L-苹果酸的回归方程为Y=0.444 3X+0.637 7，柠檬酸的回归方程为Y=0.407 8X+3.150 3，2种有机酸的峰面积与对照品溶液浓度线性关系良好，R2均大于0.999 0。

3)精密度。精密度试验中，2种有机酸的峰面积RSD均为1.45%～2.63%，表明仪器精密度良好。

4)重复性。重复性试验表明，供试溶液2种有机酸的峰面积RSD均为1.21%～2.25%，表明此方法的重复性良好。

5)稳定性。稳定性试验中，供试溶液2种有机酸的峰面积RSD均为0.89%～1.60%，表明供试溶液在40 h内稳定性良好。

6)加样回收率。2种有机酸的加样回收率和RSD见表2。

表2 加样回收率试验结果 %

由表2可知，2种有机酸的平均回收率均大于97%，RSD达到1.7%以上，加样回收率测定结果符合相关要求。

3.2 五味子有机酸含量

山西中条山太宽河保护区6个产地的五味子有机酸高效液相色谱图见图3。根据色谱图中待测成分峰面积计算6种供试品中的L-苹果酸含量和柠檬酸含量，结果见表3。

由表3可知，山西中条山野生五味子中的L-苹果酸和柠檬酸含量平均为(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g。不同产地五味子的L-苹果酸和柠檬酸含量存在极显著性或显著性差异。其中，sj-005的L-苹果酸含量最高，为(39.565±2.338) mg/g，sj-005和sj-006的柠檬酸含量最高，分别为(89.437±4.808)mg/g和(87.883±5.570) mg/g。

图3 五味子样品高效液相色谱图

表3 五味子样品中L-苹果酸和柠檬酸含量 mg/g

本研究结果表明，高效液相色谱法测定有机酸的液相色谱条件应设置为流动相A为乙腈溶液，流动相B为0.2%的H3PO4溶液，梯度洗脱为15%～60% A(0 min～25 min)、15% A(30 min)，该方法具有分析速度快、线性范围宽、精密度高、准确度好等优点。用此方法测得山西中条山太宽河保护区6个产地五味子的L-苹果酸和柠檬酸含量平均为(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g，不同产地五味子的L-苹果酸和柠檬酸含量存在极显著性或显著性差异。