MicroRNA-155靶向SOCS1基因对冠心病内皮细胞炎症损伤的影响

徐涛 王超

(1河北北方学院附属第一医院心血管内科，河北 张家石 075000；
2河北省人民医院代谢病重点实验室)

据现代研究表明，冠状动脉粥样硬化心脏病(CHD) 是由动脉内膜脂类物质的堆积引起的动脉粥样病变〔1～3〕。近几年来，CHD发病率逐年上升，发病年龄逐渐呈年轻化〔4〕。研究显示，炎症反应通过破坏动脉粥样硬化斑块的稳定性导致斑块破裂，进而导致CHD〔5～7〕。MicroRNA在CHD发病机制中起关键作用。研究〔8～10〕显示许多MicroRNA分子在调控糖脂代谢、促进血管炎症反应及平滑肌细胞增殖方面产生作用。MicroRNA-155作为一个典型多功能的MicroRNA，位于21号染色体上BIC基因的第三个外显子，此基因可以调控免疫细胞和造血细胞的发育分化，从而在炎症和抗体合成等免疫反应中发挥着重要作用〔11〕。研究发现，MicroRNA-155能够通过靶向调节细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)1表达，进而产生免疫调节作用，此作用在巨噬细胞炎症反应中观察得到〔12,13〕。本实验通过研究MicroRNA-155靶向SOCS1基因对CHD内皮细胞炎症损伤的影响，探索CHD的治疗方法。

1.1动物模型 选取纯种SD雄性大鼠24只，鼠龄3～4个月，体重(240±60)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号:SCXKC(湘)200900004，动物合格证编号:HNASLKJ20100330。饲养在塑料笼内，每笼6只。室内温度25℃，湿度65%，大鼠自行随意摄取饲料和自来水。饲养1 w适应环境，以降低应激反应。动物实验严格遵循《赫尔辛基宣言》。

1.2主要试剂 培养基DMEM购自美国Gibco公司，TRIzol组织提取试剂盒、转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，质粒提取试剂盒购自美国Promega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天，MicroRNA-155 mimics、阴性对照(miR-NC)购自吉玛公司，反转录试剂盒A5000购自Promega公司，兔抗SOCS1、GAPDH一抗购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗购自碧云天公司，AerosetTM生物化学分析仪购自美国亚培公司，Bio-rad Gel Dol EZ成像仪购自美国Bio-rad公司。

1.3病理模型的构建及分组 制备冠状动脉粥样硬化(AS)模型，分为正常组和AS组各12只。正常组喂养基础饲料，AS组喂养高脂饲料，并添加维生素D3粉剂。实验开始时，在大鼠右下肢肌肉注射维生素D3粉针剂，每隔30 d重复1次。

1.4血脂和血钙的检测 实验3个月后，采集各组大鼠动脉血，检测血脂和血钙。检测正常组和AS组血浆中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和Ca2+的浓度。

1.5冠状动脉内皮细胞的分离、培养及鉴定 将动脉组织剪碎，先后加入Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化后，加入DMEM完全培养基培养于37℃、5%CO2细胞培养箱中，待细胞生长至80%融合，加入胰酶消化细胞，调整到适宜的密度后传代并培养。细胞使用PBS洗涤后，先后加入一抗和二抗，37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色。37℃培养24 h后，使用倒置显微镜观察细胞形态，

1.6细胞转染 在大鼠冠状动脉内皮细胞中，加入同型半胱氨酸，共培养24 h，制造CHD模型。设计促MicroRNA-155表达的靶序列，合成DNA Oligo，制成双链DNA。与双酶切后的pGCSIL-GFP报告基因载体连接并转化，筛选阳性克隆细胞，提取质粒进行酶切测序。合成MicroRNA-155 mimics、MicroRNA-155 inhibitor及siSOCS1，并用脂质体包装；
将脂质体加入细胞培养基中共培养24 h，构成空白对照组、阴性对照组、MicroRNA-155过表达(MicroRNA-155 mimics)组、MicroRNA-155抑制(MicroRNA-155 inhibitor)组、SOCS1基因失活(MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1)组。

1.7双荧光素酶实验检测MicroRNA-155与SOCS1的靶向关系 通过软件http://www．microrna.org 预测MicroRNA-155与SOCS1的靶向关系。合成含MicroRNA-155结合位点的SOCS1 3′UTR启动子区序列，构建野生型质粒SOCS1 3′UTR-WT和突变型质粒SOCS1 3′UTR-MUT。使用Lipofectamine 2000试剂，将SOCS1-3′ UTR-WT和MicroRNA-155 mimic质粒共转染于293T细胞；
同时设野生型质粒转染阴性对照组(SOCS1-3′UTR-WT+NC)、突变型质粒转染阴性对照组(SOCS1-3′UTR MUT+NC)和突变型质粒转染MicroRNA-155 mimic质粒组(SOCS1-3′UTR-MUT+MicroRNA-155 mimic)。用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度。

1.8定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测检测MicroRNA-155、SOCS1 mRNA的表达水平 TRIzol试剂盒提取组织和细胞总RNA进行，酶标仪检测RNA浓度。采用反转录试剂盒A5000合成cDNA，按照SYBR方法进行qRT-PCR。MicroRNA-155上游引物：5′-GGAGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；
SOCS1上游引物：5′-CCGCTCCCACTCCGATTACC-3′，下游：5′-CCGAA GCCATCTTCACGCTGA-3′，U6上游引物：5′-CTCGC TTCGGCAGCA CA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′。

1.9Western印迹检测SOCS1蛋白表达 提取每组大鼠心肌组织和细胞蛋白，使用BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度后进行电泳。转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜后加入5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h。加入兔抗鼠SOCS1一抗，孵育4℃过夜；
再加羊抗兔二抗室温孵育2h，ECL液暗室发光显影。β-actin 作为内参，成像系统采集图像Image J软件分析。

1.10细胞活性检测 CMEC细胞悬液按接种于96孔板中，设6个平行孔/组。待细胞生长达80%融合后，按之前实验分组处理细胞。加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)液20 μl，置于37℃、5% CO2环境中培养4 h，弃去MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min后，于490 nm波长处检测每孔细胞吸光度值。细胞存活率=(试验组吸光度值-空白组吸光度值) /空白组吸光度值×100%。

1.11细胞凋亡率检测 将细胞接种于24孔板中，37℃、5% CO2环境中培养。待细胞贴壁后，使用PBS清洗细胞，并用多聚甲醛固定。加入Hochest33258工作液染色。在倒置荧光显微镜下观察细胞形态：细胞固缩、浓集且细胞核变亮为凋亡细胞。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.12白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-18和IL-1β水平 吸取细胞培养液，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液中IL-6、IL-10、IL-18和IL-1β浓度。

1.13统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2.1两组血清总胆固醇、血脂和血钙水平 与正常组比较，AS组TC、TG、LDL-C和Ca2+水平均有显著差异(P<0.05)，而HDL-C水平无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、Ca2+水平

2.2两组心肌组织中MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表达水平 与正常组比较，AS组心肌组织中MicroRNA-155 mRNA水平显著上升，而SOCS1 mRNA表达水平则显著下调(P<0.05)。见表2。

表2 两组MicroRNA-155与SOCS1 mRNA表达水平

2.3两组心肌组织中SOCS1蛋白表达水平 Western印迹法检测结果显示，与正常组(1.02±0.08)比较，AS组SOCS1蛋白表达(0.32±0.02)显著下降(P<0.05)。见图1。

图1 两组SOCS1蛋白表达水平

2.4双荧光素酶实验检测结果 生物信息网站http://www.microrna.org预测MicroRNA-155与SOCS1有靶向关系。见图2。293T细胞内共转染SOCS1-3′UTR-WT质粒和MicroRNA-155 mimics质粒。结果显示，野生型中，与SOCS1-3′UTR-WT + NC组(1.12±0.13)比较，SOCS1-3′UTR-WT + MicroRNA-155 mimics组荧光素酶活性(0.72±0.08)显著降低(P<0.05)。在突变型中，与SOCS1-3′UTR-MUT+NC组(1.13±0.15)比较，SOCS1-3′UTR-MUT+MicroRNA-155 mimics组荧光素酶活性(1.18±0.22)无显著差异(P>0.05)。

图2 MicroRNA-155靶向调控SOCS1表达

2.5冠状动脉内皮细胞形态观察及鉴定原代 冠状动脉内皮细胞培养1 d细胞形态呈鹅卵石状；
培养5～7 d时，形态呈多角形或梭形。见图3。

图3 冠状动脉内皮细胞形态(×400)

2.6各组细胞中MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表达水平 qPCR结果显示:与空白对照组比较，MicroRNA-155 mimics组中MicroRNA-155表达水平显著上升，SOCS1 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)；
而MicroRNA-155 inhibitor组中MicroRNA-155表达水平显著下降，SOCS1 mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表达水平

2.7各组细胞中SOCS1蛋白表达水平 Western印迹结果显示，与空白对照组(1.01±0.05)比较，MicroRNA-155 mimics组中SOCS1的蛋白表达水平(1.76±0.32)显著上升；
而MicroRNA-155 inhibitor组中SOCS1的蛋白表达水平(0.41±0.04)显著下降(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组(1.06±0.03)和MicroRNA-155 inhibitor + siSOCS1组SOCS1蛋白水平(0.62±0.05)差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

1：空白对照组；
2：阴性对照组；
3：MicroRNA-155 mimics组；
4：MicroRNA-155 inhibitor组；
5:MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1组；
图5同

2.8各组细胞活性 MTT法检测结果显示，与空白对照组(0.62±0.04)比较，MicroRNA-155 mimics组细胞活性(0.38±0.02)显著下降(P<0.05)；
MicroRNA-155 inhibitor组细胞活性(1.02±0.03)显著上升(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组(0.65±0.06)和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1组细胞活性(0.72±0.05)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.9细胞凋亡率检测 细胞进行冠心病应激后，使用Hochest33258染色，出现细胞核残缺、核固缩、染色质浓集等凋亡特征。与空白对照组(15.32%±3.28%)比较，MicroRNA-155 mimics组细胞凋亡率(31.65%±4.12%)显著升高(P<0.05)；
而MicroRNA-155 inhibitor组细胞凋亡率(8.19%±4.37%)显著降低(P<0.05)。MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1组的凋亡率(13.29%±2.34%)与空白对照组和阴性对照组(16.61%±3.87%)差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 Hochest33258染色检测各组细胞凋亡(×400)

2.10各组细胞炎症因子表达水平 与空白对照组和阴性对照组比较，MicroRNA-155mimics组IL-1β、IL-6和IL-18含量显著上升，而IL-10含量显著下降(P<0.05)；
而MicroRNA-155 inhibitor组中IL-1β、IL-6和IL-18含量显著下降，IL-10含量显著上升(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1组IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18含量无显著差异(P>0.05)。见表4。

表4 各组细胞炎症因子表达水平

现代社会，人们的生活水平逐渐升高，医疗卫生条件也持续改善，使得人口老龄化加剧，进而导致老年性疾病的发病率逐年上升，其中最严重的便是AS〔14〕。AS是许多重要血管事件的病理基础，其造成的心血管疾病在全球发病率和死亡率中居于首位〔15〕。因而对AS的发病机制及病理基础进行深入研究具有重大意义。现代研究表明，免疫炎症反应在AS的发生及发展过程中有重要作用。

MicroRNAs是近年来新发现的一类内源性非编码RNA分子，普遍存在于真核生物中，通过抑制其标靶分子的表达，进而发挥在肿瘤发生、免疫炎症等生命过程中重要的调节作用〔16，17〕。MicroRNA-155是与炎症关系最为密切的MicroRNAs之一，许多研究发现 MicroRNA-155 在AS病人中呈高表达〔18〕。并且，MicroRNA-155能通过调控不同的靶标分子来调节巨噬细胞炎症反应、脂质摄取，进而在AS中发挥重要的作用〔19〕。SOCS细胞产生，包括SOCS1～7，是一种反馈性的负性调节因子。通过阻断细胞因子信号传导，进而参与人体多种炎性疾病的发生发展〔20〕。包括SOCS1在AS的炎症机制中发挥着重要作用，研究表明SOCS1可负性调节免疫细胞中干扰素(IFN)和Toll样受体介导反应〔21〕：SOCS1缺陷小鼠成纤维细胞、DC细胞、巨噬细胞对脂多糖(LPS)和Toll样受体配体均高度敏感，促进动脉粥样硬化斑块形成〔22〕的炎性细胞因子，如IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IFN-γ的分泌量均增高。

现代研究证明，IL-1β通过结合IL-1受体1，是重要的炎症信号之一〔23，24〕。本实验结果显示，MicroRNA-155过表达可抑制冠心病大鼠心肌微血管内皮细胞活力，并使细胞凋亡率上升。因此，MicroRNA-155可靶向抑制SOCS1增加冠心病大鼠心肌微血管内皮细胞的凋亡率。MicroRNA-155通过抑制SOCS1表达，从而促进炎症因子的表达，使细胞产生炎症损伤。

综上，MicroRNA-155通过靶向抑制SOCS1基因，促进冠心病大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡，提高促炎因子IL-1β、IL-6 和IL-18表达，从而大鼠心肌微血管内皮细胞炎症损伤。