骨髓间充质干细胞膜片复合磷酸三钙陶瓷构建工程化骨组织的体内成骨研究|捐骨髓和捐干细胞

　　[摘要]目的：探讨骨髓间充质干细胞膜片复合磷酸三钙支架材料构建组织工程骨的可行性。方法：将兔骨髓间充质干细胞高密度接种于普通培养皿，在成骨诱导条件下连续培养2周，获得细胞膜片，修剪成长方形，并由一端卷起包裹圆柱状的磷酸三钙材料。静置孵育24h后将构建物移植到裸鼠背部皮下。术后6周取材，进行大体观察、组织学检查、组织定量学分析。结果：所获骨髓间充质干细胞膜片有多层细胞组成，保留了细胞外基质。实验组在材料表面及其孔隙内有较多的骨质形成；单一材料组空隙内为纤维组织，未见骨或软骨样组织；单一膜片组见片状编织骨形成。 结论：骨髓间充质干细胞膜片在体内具有良好的成骨能力，可作为细胞释放载体与磷酸三钙支架复合构建骨组织。本研究为骨组织工程构建提供了新的方法。
　　[关键词]骨髓间充质干细胞；骨组织工程；细胞膜片；磷酸三钙
　　[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）03-0408-03
　　
　　Engineering bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell sheet and β-tricalcium phosphate ceramic
　　MA Dong-yang1,MA Jing2,JIANG Dong-hong3,WANG Jian-feng3
　　(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,2. Department of Otolaryngology,3. Department of Medical Administration，Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730052,Gansu,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) sheet and β-tricalcium phosphate ceramic (TCP).MethodsWe first harvested a cell sheet from rabbit BMSCs using a continuous culture method and a scraping technique. The cell sheet was then wraped around a cylinder of β-TCP. Finally,the constructs were implanted into the subcutaneous pockets of nude mice for in vivo experiments. Gross view and histological examinations were performed to evaluate the harvested specimens. Results The cell sheet, with an average thickness of 158 mm, was composed of multi-layered cells separated in the extracellular matrix. Six weeks after implantation, the new bone tissue was present both on the edge and at the center of the TCP in sheet-TCP group. A layer of woven bone formed in the cell-sheet group. In contrast, the TCP was filled only with fibrous tissue in the TCP group,without evidence of bone formation.ConclusionThe study indicates that the combination of osteogenic BMSC sheet and β-TCP ceramic can engineer bone tissue and the engineered construct might be considered as a promising substitute for bone repair.
　　Key words:bone mesenchymal stem cell; bone tissue engineering; cell sheet; β-tricalcium phosphate
　　
　　近年来，随着再生医学的迅速发展，组织工程有望为骨缺损提供理想的修复方法[1]。组织工程骨的传统构建方法是将具有成骨分化功能的种子细胞与三维支架材料复合[1-2]。细胞在体外扩增后常用胰蛋白酶消化成离散细胞悬液，在此过程中，细胞自分泌的细胞外基质、细胞-基质连接、以及细胞-细胞连接等结构都被破坏，而这些结构对于细胞分化、特异性表型维持、分泌、组织形成等功能非常重要[3]。再者，细胞与支架材料直接复合的方法存在细胞利用率低的缺点[4]。为了解决上述问题，我们提出新的组织工程构建策略，即应用细胞膜片与可降解的外源性支架材料复合来构建工程化骨组织。为验证这一构想，本研究选用来源丰富、容易获取、体外扩增速度快、安全实用性、无伦理学争议的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)作为种子细胞来构建细胞膜片，同时选择具有良好的生物相容性、可降解性、与松质骨的结构类似的多孔样磷酸三钙(β-tricalcium phosphate, TCP)作为支架材料。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料：3月龄成年新西兰大耳白兔，体重2.6～3.0kg，雌雄不限，由兰州军区总医院动物中心提供。6周龄裸鼠(NIH strain, outbred) 购自中国科学院上海实验动物中心。DMEM培养基（购自Gibco, Invitrogen Corp）；L－谷胺酰胺、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胰蛋白酶（均购自美国Sigma公司，胎牛血清(杭州四季青公司)，CO2细胞培养箱(Forma公司3110Ⅱ，美国)，倒置显微镜及照相系统(Olympas IX71. A21PH, 日本)，离心机(Heraens Cryofuge 8000, 德国)，一型超净工作台（苏州净化设备厂）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 兔BMSCs分离、培养、及细胞膜片构建：氯胺酮（10 mg/kg）肌内注射麻醉下，切取兔双侧髂骨并劈开，用含200 U/ml肝素的低糖DMEM冲洗髓腔、过滤骨髓、离心、弃上清、加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种到直径为10cm的普通培养皿里。加入含100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、0.27g/L L-谷胺酰胺的低糖DMEM，置于37℃、5% CO2的孵箱内培养，每隔2天更换培养液一次。当细胞达90%融合时，用0.25%胰酶消化后按1:3 传代，换成含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，90%融合时再消化，按密度1×105个/cm2接种到直径为10cm的培养皿。细胞融合后，更换为含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞水松，50mg/L抗坏血酸，10mmol/L β-甘油磷酸钠的高糖DMEM条件培养液，每隔2 天换培养液1次，经2周的连续培养，用细胞刮刀由外周向中心沿底壁仔细刮起，获得完整的细胞膜片[5]。
　　1.2.2 细胞膜片显微结构观察：随机选取所获细胞膜片，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切成5μm厚切片，苏木精－伊红染色（H&E）光镜下观察组织结构。部分膜片样本经丙酮固定，钙钴法进行碱性磷酸酶染色。部分膜片经2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脱水，干燥，喷金，扫描电子显微镜观察标本表面形貌及层面结构。
　　1.2.3 体内试验：实验组将单层细胞膜片剪切成10mm×25mm的长方形状（图1A），并由一端卷起包裹预制成的TCP圆柱体（直径0.8cm，高度1.0cm，70%孔隙率，平均孔径450± 50μm，图2A、B），静置孵育24h后移植到裸鼠背部皮下。作为对照，相同大小的细胞膜片和同规格经成骨培养基孵育24h的单纯材料也进行皮下移植。术后6周处死动物取材，进行大体观察及组织形态学分析：①组织学定性分析：各样本经石蜡包埋、切片后HE及Mallory 三色染色光镜观察；②组织学半定量分析：每组每例样本连续4张5μm厚切片，横贯整个样本，Mallory 三色染色后由独立的观察者采用NIH Image J图像分析系统在10倍镜下分析切片中骨样组织（砖红色）与纤维组织（淡蓝色）所占的面积百分比。每张切片随机选取4个视野，计量后收集各组数据，取其平均值。
　　
　　2结果
　　2.1 膜片的构建：融合BMSCs经过2周连续培养，皿底有透明乳白色薄膜样物质形成，表面散在多个白色结节。用细胞刮沿皿底轻刮即可使其与培养皿底分离，刮起后膜片自行收缩，具有弹性和较稳定的机械性能，可以用镊子或血管钳进行钳夹操作。HE染色，所获膜片具有类似三维结构，由约8～10层细胞及细胞外基质组成，厚度平均158μm （图1B）。扫描电镜下观察：膜片中细胞被细胞外基质包埋，基质表面可见矿化结节聚集（图2C）。
　　2.2 体内实验
　　2.2.1 移植6周后：实验组和TCP组取材标本的形状与移植前无明显变化，但前者表面较硬，容易与周围软组织分离，后者表面被覆一层质软的纤维组织，不易分离。膜片组见纸片状硬质组织形成。
　　2.2.2 组织学结果：实验组的外周表现为矿化程度较高的板层状骨组织，可见致密骨基质、骨陷窝、骨细胞、成骨细胞等结构，材料内部的孔隙中央为纤维组织，周边见低度矿化的小梁骨（图3A、B、C）。组织定量学分析，骨与纤维组织的所占面积分别为22.5%和59.6%。单一TCP组孔隙内为纤维组织（面积比为76.1%），未见骨或软骨样组织。单纯膜片组见片状编织骨形成，致密的骨基质中可见类髓腔样结构（图3D）。
　　
　　3讨论
　　本研究证实了BMSC膜片与多孔TCP支架材料复合构建组织工程骨的可行性。与传统方法相比，本研究应用的构建方法具有以下优点：①采用物理刮治的方法将体外扩增的细胞连同培养过程中自分泌的细胞外基质、形成的细胞基质连接一同收集，避免了传统用胰蛋白酶消化的有创收集方法；②具有较高的细胞利用率。
　　细胞膜片技术由日科学家Okano等[6]发明，他们将温度敏感性聚合物凝胶涂层于普通培养皿底壁制备出了温敏性培养皿，在37℃时聚合物对其表面扩增融合的单层细胞膜片有绝对亲和性，但降至其临界溶液温度32℃以下时，此聚合物对单层细胞膜片的亲和性消失，使细胞膜片自动从培养皿底壁释放。该培养技术避免了对细胞进行传统胰蛋白酶消化等处理，进而保留了细胞自分泌的细胞外基质以及一些重要的细胞表面蛋白如离子通道、生长因子受体、细胞-细胞连接蛋白。利用此技术，角膜、皮肤、心肌、肝组织等多种细胞密集型软组织已被成功构建[3]，但在用于骨组织方面的研究较少。2007年，Zhou等[4]首先报道用细胞膜片技术与复合离散细胞悬液的聚合物-陶瓷材料（磷酸三钙-聚已酸内酯复合物）构建出组织工程骨；Gao等[7]则用多层细胞膜片与管状珊瑚构建出管型骨。Okano等获取膜片的技术操作程序较复杂，而且应用温敏聚合物，可能会影响细胞的增殖分化。同时该技术获得的膜片为单层细胞组成，厚度只有约10μm[8]。相比之下，我们的细胞膜片获取方法简单易行，无需特殊材料或者设备，而且由多层细胞及细胞外基质组成，厚度可达158μm，更像三维结构的组织。另外，一定的厚度赋予了膜片相应的弹性和较稳定的机械性能，增加了可操作性。本研究则用单层膜片与已用于临床的人工骨替代材料TCP复合。
　　有趣的是，实验组中，不仅在支架材料的外周有矿化程度较高的骨组织形成，而且在材料内部也可见相当数量的骨小梁。这一结果表明：作为细胞释放载体系统，细胞膜片可赋予无机材料以生物活性。另一个有趣的结果是，与单纯材料组相比，实验组材料孔隙结构内的纤维组织量较少，意味着细胞膜片在促进成骨的同时阻止了纤维组织的张入，有望成为新型的具有生物活性的组织引导再生膜。
　　组织工程骨要取代自体骨移植大范围应用于临床，首先需要解决大体积支架内部细胞的氧气、营养供应以及代谢产物排泄。种子细胞在体外依赖于培养介质提供营养，而植入到体内后，如同非血管化的游离骨移植，则需依靠受区组织液的弥散渗透作用获得营养。然而，理论上体内环境通常所能提供的最大弥散距离是150～200μm，因此大体积复合物内相当数量的细胞因为无法获取营养物质并排泄代谢产物而死亡[9-10]。尽管已有诸多方法可促进组织工程植入物与宿主血管网的紧密联系，提高细胞成活率和组织修复功能，但目前为止，任何促进血管生长的方法都需要5～7天以上时间才能使植入细胞获得血液供应，在这段时间内，细胞需从组织液中获得足够营养[10]。本实验所应用的BMSC膜片厚度为 158μm左右，在有效组织弥散范围内。我们推测将其植入体内后易于成活，有利于提高细胞治疗的效率。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Meijer GJ,de Bruijn JD,Koole R,et al. Cell-based bone tissue engineering[J]. PLoS Med,2007,4(2):e9.
　　[2]Quarto R,Mastrogiacomo M,Cancedda R,et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells[J].N Engl J Med,2001,344(5):385-386.
　　[3]Yang J,Yamato M, Shimizu T, et al. Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering[J]. Biomaterials,2007,28(34):5033-5043.
　　[4]Zhou Y,Chen F,Ho ST,et al. Combined marrow stromal cell-sheet techniques and high-strength biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts[J]. Biomaterials,2007,28(5):814-824.
　　[5]Ma D,Ren L,Liu Y,et al. Engineering scaffold-free bone tissue using bone marrow strom cell sheets[J].J Orthop Res,2010,28(5):697-702.
　　[6]Okano T,Yamada N,Sakai H,et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide)[J].J Biomed Mater Res,1993,27(10):1243-1251.
　　[7]Gao Z,Chen F,Zhang J,et al. Vitalisation of tubular coral scaffolds with cell sheets for regeneration of long bones: a preliminary study in nude mice[J].Br J Oral Maxillofac Surg,2009,47:116-122.
　　[8]Iwata T,Yamato M,Tsuchioka H,et al. Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].Biomaterials,2009,14:2716-2723.
　　[9]Ren LL,Ma DY,Feng X,et al. A novel strategy for prefabrication of large and axially vascularized tissue engineered bone by using an arteriovenous loop[J].Med Hypotheses,2008,71(5):737-740.
　　[10]Jain RK,Au P,Tam J,et al. Engineering vascularized tissue[J].Nat Biotechnol,2005,23(7):821-823.
　　
　　[收稿日期]2010-12-06 [修回日期]2011-03-04
　　编辑/张惠娟