[大鼠骨髓间充质干细胞与成纤维细胞差异蛋白质组学研究]大鼠成纤维细胞

　　[摘要]目的：进行大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）与成纤维细胞（FBs）细胞的蛋白质组学研究，寻找出重要的差异蛋白质。方法：采用二维电泳的方法（2DE）分别分离两种细胞的蛋白质，用PDQuest软件分析蛋白表达差异，并采用质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。结果：发现了MSCs和FBs之间存在差异表达的15种蛋白质，其中4种蛋白质差异显著且与细胞功能密切相关，即SM22-α、鸟嘌呤脱氨基酶（Guanine deaminase，GD）、膜联蛋白（Annexin A5）、过氧化物岐化酶-2（superoxide dismutase 2，SOD-2）。MSCs 的SM22-α和Annexin A5的表达分别比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表达分别比FBs高16倍和21倍。结论：与大鼠FBs相比，MSCs存在更多防止细胞损伤相关的蛋白质和更少的与细胞衰老过程密切相关的蛋白质，具有高分化潜能，更适合于作为组织工程种子细胞。
　　[关键词]骨髓间充质干细胞；成纤维细胞；蛋白质组学
　　[中图分类号]Q831[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1021-05
　　
　　Comparative proteomic analysis of mouse mesenchymal stem cells and skin-derived fibroblasts
　　SUN Yang1,ZHAO Liang2,WEI Xu-feng2,YI Wei2,GUO Shu-zhong1
　　（Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi"an 710032, Shaanxi,China）
　　
　　Abstract:ObjectiveTo analysis and to compare the proteomic differences between mesenchymal stem cells(MSCs) and fibroblasts(FBs), and to discover the key different proteins.MethodsSeparate the protein of cells by 2 dimension electrophoresis（2DE）, analysis the differences of protein expression with PDQues, and identify with MALDI-TOF-MS. ResultsDiscover fifteen different types of proteins, four of which associate with different functions of MSCs and FBs. Those are SM22-alpha, Guanine deaminase(GD), Annexin A5 and superoxide dismutase 2 (SOD-2). the expression of SM22-αand Annexin A5 in MSCs is separately 26 folds and 8 folds lower than in FBs, but MSCs express GD and SOD2 16 folds and 21 folds higher than FBs.ConclusionCompared with FBs, MSCs express more kinds of proteins that can prevent the damage of themselves, while have fewer proteins associated with aging in expression. Plus pluripotent differentiation potential, they are better seed cells for tissue engineer.
　　Key words: mesenchymal stem cells; fibroblasts; proteome
　　
　　骨髓间充质干细胞（MSCs）与成纤维细胞（FBs）都可作为组织工程种子细胞，两者都具备分泌细胞外基质的能力，且MSCs可在一定条件下诱导分化为FBs。然而，MSCs具备生长和分化的能力，FBs却不具备分化潜能。本研究从蛋白质组水平比较MSCs与FBs蛋白表达的差异，试图找到使MSCs具备分化潜能的关键蛋白质，深入了解导致MSCs与 FBs不同功能的结构基础，为进一步深入研究和改建 MSCs成为具有完全功能的组织工程种子细胞打下基础。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 试剂、仪器及动物
　　1.1.1 试剂： DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；双抗(青霉素、链霉素)、EDTA钠、肝素钠、Percol1分离液均购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自四季青公司；CD34，CD29，CD45和FITC标记的二抗均购自美国SantaCruz公司；溶液均由Milli-Q水配制而成；其它试剂均为分析纯。
　　1.1.2 仪器：二维电泳系统及PDQuest凝胶分析软件购自美国Bio-Rad公司；Powerlook 2100XL凝胶图像扫描仪购自美国UMAX公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购自德国。
　　1.1.3 动物：SD大鼠子鼠，雄性，年龄 16～17天，购自第四军医大学实验动物中心。
　　1.2 方法
　　1.2.1 大鼠MSCs的分离与培养：选用雄性SD大鼠子鼠，用体积分数为3.5％的水合氯醛腹腔注射麻醉。分离出四肢骨，用DMEM培养基冲洗骨髓腔。将冲洗获得的溶液以300g/min的速度离心5min。弃上清液，再用培养基重悬沉淀，加入到梯度Percoll液中，以900g/min的速度离心20min。吸取交界面处云雾状层，用含质量分数为10％FBS的DMEM培养基重新悬浮，以300g/min的速度离心5min，弃上清液，置于培养瓶内接种，培养。24～48h后更换培养液，弃去未贴壁细胞。5～6天消化分瓶传代培养。
　　1.2.2 大鼠FBs的分离与培养：处死大鼠，用75％酒精浸泡3～5min，切取2cm×3cm大小背部皮肤2块，用PBS缓冲液清洗2～3次。然后将其切成长约1cm宽0.3～0.5cm左右的皮条。用浓度为2.4U/mlDSP酶在37℃消化1～1.5h左右，撕去表皮层，将真皮层剪成约1mm3的碎块，移入5ml胶原酶，在37℃培养箱中消化1～1.5h，每20min左右振荡，消化到组织块散开为止。加培养液稀释胶原酶，用吸管吹打，再用100目的钢网过滤，祛除剩余的组织块。收集细胞悬液，以300g/min的速度离心9min，细胞记数，以2×105/ml的细胞量接种，置于培养箱中培养。
　　1.2.3 MSCs表面抗原的鉴定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收获第3代细胞，其分别与抗CD29，CD34，CD45的单克隆抗体饱和溶液在室温下反应30min，然后用PBS洗涤2次，再与FITC标记的二抗避光作用15min。最后用PBS洗涤并重悬于PBS中，对MSCs表面抗原进行流式分析。
　　1.2.4 蛋白分离及图像分析：消化分离出细胞，在4℃以3 000r/min的速度离心10min，弃去上清液，加入预冷的PBS洗涤3次。在裂解液中重悬细胞，在冰浴冷却下超声破碎细胞。分别加入脱氧核糖核酸酶200ml和核糖核酸酶50mL，于4℃放置15min，以12 000r/min的速度离心30min。收集上清液，用Bradford法测定蛋白含量，在-80℃中保存蛋白样品。采用2DE方法分离细胞蛋白提取物。
　　1.2.5 质谱分析及数据库检索：对蛋白点胶内酶切，提取多肽混合物。用MALDI-TOF-MS法(Voyager-DE)检测蛋白多肽。采用moverz软件对多肽质谱进行校正，通过peakErazor软件去除各种污染，如胰酶自降解峰以及角蛋白污染峰等。采用不同的检索引擎(Aldente, Profound, MS-Fit)对两种不同的数据库(NCBInr和Swiss-Prot)蛋白进行数据检索[1]。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 MSCs和FBs形态观察：MSCs和FBs形态相似，均呈梭形贴壁生长（图1）。
　　
　　2.2流式细胞仪对大鼠MSCs表面抗原鉴定结果：大鼠MSCs表面抗原 CD29呈阳性，而CD34和CD45呈阴性，表明实验所用细胞为MSCs，并且在增殖过程中能够保持其特征。可排除造血干细胞的污染（图2）。
　　2.3 特征蛋白的鉴定：采用pH=3～10的IPG胶条分离MSCs和FBs蛋白提取液，结果见图3。PDQuest软件分析MSCs和FBs蛋白点变化情况。结果表明：MSCs与FBs表达的蛋白质谱很相似，但仍存在差异。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白点有3个，MSCs多而FBs少的蛋白点有5个，MSCs少而FBs多的蛋白点5个，MSCs没有而FBs有的蛋白点有2个。这些蛋白点将作为质谱分析的对象进行胶内酶解及质谱分析，成功地鉴定出4个有意义的蛋白点，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。MSCs 的SM22-α和Annexin A5的表达分别比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表达分别比FBs高16倍和21倍。4个蛋白点的肽质量指纹图谱如图4所示。
　　
　　3讨论
　　
　　FBs曾作为组织工程种子细胞，但其功能存在缺陷。MSCs是一种多能干细胞，具有自我增殖和多向分化的潜能，目前认为其作为组织工程种子细胞有很好的应用前景。在一定条件下，MSCs可诱导分化为FBs，但MSCs与FBs的蛋白组学功能差别的分子结构基础，尚未见深入研究报道。本试验对大鼠MSCs和FBs研究发现这两种细胞形态相似，均呈梭形，并均贴壁生长。MSCs表面抗原CD29为阳性，CD34和CD45为阴性。本研究进一步对两种细胞进行蛋白分离和蛋白组学比较研究，发现MSCs与FBs表达的蛋白质谱很相似，但仍存在差异。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白点有3个，MSCs多而FBs少的蛋白点有5个，MSCs少而FBs多的蛋白点5个，MSCs没有而FBs有的蛋白点有2个。将这些蛋白点作为质谱分析的对象进行胶内酶解及质谱分析，成功地鉴定出4个有意义的蛋白点，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。细胞蛋白表达上的差异，导致了两种细胞具有不同的功能，通过蛋白质组的鉴定，我们发现以上四种主要差异的蛋白质均与MSCs保持高度增殖和分化能力有关。
　　
　　
　　SM22-a可在多种间质细胞中表达[2]，与细胞的衰老有关，分化程度越高的细胞表达SM22-a越多[3]。蛋白质组的研究结果显示MSCs与FBs相比SM22-a表达少，说明MSCs分化程度较低，是更年轻的细胞，具备高分化潜能。GD是核苷酸代谢的关键酶，催化水解的脱氨基作用，使鸟嘌呤转化为黄嘌呤[4-5]。GD在细胞成熟过程中发挥重要作用[6]。蛋白质组的结果显示MSCs表达的GD比FBs表达多，证实了MSCs是未成熟细胞，仍含有较多的促进细胞成熟的酶功能活跃，催化细胞的成熟。
　　Annexin A5是与细胞衰老过程密切相关的蛋白，在细胞凋亡的过程中，Annexin A5相互结合[7]。蛋白质组的结果显示MSCs表达的Annexin A5比FBs少，提示MSCs是比FBs更年轻的细胞。SOD-2是一种抗氧化剂，可以提高多种酶mRNA的水平，SOD-2水平的提高可以防止细胞的损伤[8]。蛋白质组的结果显示MSCs表达的SOD-2水平高于FBs，提示MSCs处于较幼稚的阶段，机体对其产生了良好的保护机制[9]。
　　综上所述，MSCs和FBs蛋白表达谱相似，故具有相似的生物学功能，均可作为组织工程种子细胞。但两者蛋白表达仍存在不同，导致了两者功能的差别。本研究第一次从蛋白水平阐述了MSCs和FBs不同功能与蛋白表达差异的关系，找到了4种有意义的差异蛋白质，可以更深入的理解MSCs具备高分化潜能而FBs不具备的原因，为选择更适合的组织工程种子细胞提供了更多的理论依据，并由此推断MSCs作为组织工程种子细胞具有更广泛应用的前景。
　　
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　　[收稿日期]2008-02-21[修回日期]2008-05-13
　　编辑/张惠娟