[基质金属蛋白酶抑制剂抗光老化的研究进展]胱氨酸蛋白酶抑制剂

　　 紫外线(UV)照射引起的皮肤老化称为皮肤光老化,UV照射可诱导有活性的基质金属蛋白酶(MMPs)过度表达,继而降解胶原蛋白等真皮细胞外基质成分,导致皮肤光老化。本文简述了MMPs在皮肤光老化中的作用,并详细阐述了MMPs抑制剂在抗光老化中的研究进展。
　　
　　1MMPs在皮肤光老化中的作用
　　皮肤光老化的主要临床表现是皱纹、斑点状色素沉着和皮肤粗糙等。长期日光照射可影响皮肤的多种细胞成分和组织结构改变,其中最具特征性的变化是真皮成分的改变。真皮的主要成分包括弹力纤维、胶原纤维、氨基多糖等基质,在光老化皮肤中,I型与III型胶原纤维减少、紊乱,弹性纤维变性、变粗,聚集成块,氨基多糖裂解,导致皮肤松弛、皱纹的发生。UV照射诱导的MMPs活化在真皮细胞外基质蛋白的降解过程中发挥着重要的作用。MMPs是一个含锌蛋白酶家族,由MMP-1、MMP-2、MMP-3等25名成员组成,其中有24种在哺乳动物表达。UVA、UVB和UVC均可诱导角质形成细胞和成纤维细胞分泌以MMP-1、MMP-3和MMP-9为主的MMPs[1],分泌的MMPs可特异性降解几乎所有的细胞外基质。不同类型的MMP降解不同的真皮基质蛋白,例如:MMP-1降解I、II和III型胶原蛋白,MMP-9降解IV、V胶原蛋白和明胶,而MMP-3则有更广泛的底物特异性,它可以降解多种类型的胶原蛋白及基质分子,如蛋白多糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白。对于胶原蛋白,尤其是I型和III型胶原蛋白,首先由MMP-1启动胶原纤维断裂,然后被升高的MMP-3和MMP-9进一步降解[1]。因此,长期的UV照射会导致MMPs产生过量,继而降解皮肤的细胞外基质成分,引起皮肤松弛、皱纹形成等光老化改变。
　　
　　2 MMPs抑制剂在抗光老化中的研究进展
　　MMPs可以特异性降解几乎所有基质,造成皮肤光老化。因此,抑制MMPs的上调即可达到抗光老化的作用。UV照射诱导MMPs活化涉及复杂的信号通路,其中最重要的就是MAPK和NF-κB信号通路[2-3]。UV照射引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生被认为是激活上述两条信号通路的一个始动环节[4],而活性氮(reactive nitrogen species,RNS)可能协同ROS参与UV介导的MMPs的表达[5]。因此,阻断这些信号通路或者阻断ROS、RNS的产生便可抑制MMPs达到抗光老化的作用。到目前为止,已有大量的化合物被实验证明能抑制MMPs的表达,它们分别以ROS、MAPK通路、NF-κB通路或多个环节为靶点达到抗光老化的作用。
　　2.1 以ROS为靶点的MMPs抑制剂:UV照射引起的ROS通过激活MAPK和NF-κB信号通路而诱导多种MMP的活化。因此,抗氧化剂可通过清除ROS达到抗光老化的作用。ROS是指化学性质活跃的含氧原子或原子团,如过氧化氢(H2O2)、超氧自由基(・O2-)、羟自由基(OH・)、单态氧(1O2)等。传统的抗氧化剂如维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、番茄红素、辅酶Q10等,它们因具有美白祛皱的作用而被广泛用于抗衰老化妆品中。近年来,有大量的新型抗氧化剂被研发出来,它们主要来自于天然生物如白绒水龙骨叶提取物、叶黄素等。这些物质可通过清除ROS而抑制MMPs的表达。
　　白绒水龙骨叶提取物(polypodium leucotomos extract,PLE)是一种已知的天然抗氧化剂,它可直接清除・O2-、OH・、1O2等ROS。在体内和体外实验研究证实它能够抑制UV诱导的ROS生成以及随后的膜损伤和脂质过氧化。PLE也是一个光保护剂,在动物模型中它能改善与光老化相关的组织学改变,降低人皮肤的光毒性和光敏作用,防止成纤维细胞的形态学改变,以及刺激成纤维细胞合成弹性蛋白。Philips 等[6]发现它可直接抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的活性,显示其可能是一种MMPs抑制剂。进一步研究发现,它可以抑制成纤维细胞MMPs的表达,而刺激MMPs的内源性抑制剂-金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)的表达。在UV辐射的成纤维细胞,PLE可以增加弹性蛋白的表达,刺激I型、V型胶原蛋白和TGF-β的表达,抑制MMP-1的表达。因此,PLE对细胞外基质显示双重的保护作用,既能抑制MMPs的表达又能刺激胶原蛋白的合成。
　　叶黄素(lutein)为一种天然存在于蔬果中的类胡萝卜素,也是一种很好的抗氧化剂。Philips等[7]研究证实用叶黄素处理的成纤维细胞可以防止UV诱导的细胞活性的下降以及细胞膜的损伤。而且,它还能显著抑制皮肤成纤维细胞MMP-1和MMP-2的表达,但对TIMPs表达没有影响。因此,叶黄素可通过纠正MMPs/TIMPs比率失衡以及抑制细胞消亡、膜损伤达到抗光老化的作用。
　　小珊瑚藻(corallina pilulifera)是一种海产红藻。Ryu等[8]研究发现小珊瑚藻提取物可以防止OH・造成的DNA损伤以及抑制细胞内ROS的水平,具有较强的抗氧化活性。而且,它能够抑制人皮肤成纤维细胞中由UV诱导的MMP-2和MMP-9的表达而具有抗光老化的作用。
　　欧亚花楸(sorbus commixta hedl)是一种用于治疗咳嗽、哮喘等支气管疾病的传统中药。欧亚花楸甲醇提取物具有很强的抗氧化活性,而水解酶处理的欧亚花楸提取物具有更强的抗氧化活性,其中葡聚糖酶处理的欧亚花楸提取物的抗氧化活性最强。β-葡聚糖酶处理的欧亚花楸提取物(β-GSCoE)能有效清除自由基以及增强UV辐射的人皮肤成纤维细胞的活性。在UVA辐射的人皮肤成纤维细胞中,β-GSCoE能够剂量依赖性促进MMP-1mRNA和蛋白的表达[9]。因此,β-GSCoE可能是一种有效的抗光老化成分。
　　2.2 以MAPK信号通路为靶点的MMPs抑制剂:UV照射人皮肤可以激活角质形成细胞和成纤维细胞内MAPK信号通路而诱导MMPs的表达。在哺乳类细胞目前已发现存在三条并行的MAPK信号通路:细胞外信号调节激酶(ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路和p38MAPK通路,而UV刺激可以激活上述三条并行的MAPK信号通路。该信号通路激活后最终造成转录因子AP-1的活化,活化的AP-1与MMPs启动子的AP-1位点结合使得启动子被反式激活而导致MMPs的表达[10]。因此,阻断MAPK通路便可下调MMPs的表达。到目前为止,已有大量的化合物如维A酸、反式玉米素等可通过阻断UV介导的MAPK通路以抑制MMPs的表达。
　　维A酸(retinoic acid,RA)是目前研究最多的抗光老化制剂,其中0.05%的全反式RA霜是美国FDA批准的治疗皮肤光老化的产品。大量的数据表明RA具有预防和治疗皮肤光老化的作用。局部外用RA能明显改善皮肤光老化的临床表现,消除或减少皱纹形成,改善肤色和皮肤纹理、增加弹性,防止光照皮肤胶原蛋白的丢失和刺激胶原蛋白的形成。实验证明,在抗光老化方面,RA通过与角质形成细胞的RA受体γ(RAR2γ)及异维A酸受体α(RXRα)结合激活泛素/蛋白酶体途径,活化的泛素/蛋白酶体途径引起MAPK通路中c-Jun的降解,阻止了c-Jun的升高,最终导致AP-1和MMPs的表达降低[11]。
　　玉米素是从玉米须中纯化的一种天然细胞分裂素,反式玉米素(trans-Zeatin)是其活性更稳定的形式。Yang 等[12]发现反式玉米素处理人成纤维细胞后能剂量依赖性地抑制UVB诱导的MMP-1表达和c-Jun的活化。它还能抑制UVB诱导的ERK、JNK和p38MAPK磷酸化。这些结果提示反式玉米素能够通过阻断ERK、JNK和p38MAPK信号通路抑制MMP-1的表达。
　　岩藻依聚糖(fucoidan)是一种从褐藻提取的硫酸多糖。Moon 等[13]研究发现,它能够抑制UVB诱导的人皮肤成纤维细胞的MMP-1启动子活性以及MMP-1mRNA和蛋白的表达,并促进I型前胶原蛋白mRNA和蛋白的表达。进一步研究发现,它还能抑制UVB诱导的ERK的活化,但对JNK的活化影响较弱。因此,岩藻依聚糖可通过拮抗ERK通路达到抑制MMP-1的表达。
　　2.3 以NF-κB信号通路为靶点的MMPs抑制剂:UV刺激也可触发NF-κB信号通路而诱导皮肤MMPs的表达增高。NF-κB是一种可诱导的二聚体转录因子,它属于转录因子NF-κB/Rel家族。哺乳动物细胞中有五种NF-κB/Rel:p65、RelB、C-Rel、p50和p52,能形成同或异二聚体,启动不同的基因转录。NF-κB二聚体最初与NF-κB的抑制因子IκB结合成三聚体,以非活性的形式存在于细胞质中。UV照射可以诱导IκB激酶(IKK)活化,活化的IKK导致IκB磷酸化,促使NF-κB从复合物中释放出来,并转移到细胞核中,通过与MMPs启动子的NF-κB位点结合介导多种MMPs的转录。因此,阻断NF-κB信号通路的关键环节便可下调MMPs的表达而达到抗光老化的作用,例如:虫草素、威灵仙提取物等可通过抑制UV介导的NF-κB通路抑制MMPs的表达。
　　虫草素(cordycepin)是蛹虫草中的主要活性成分,威灵仙(radix clematidis)是一种药用植物,Lee 等[14-15]研究了虫草素和威灵仙提取物对人皮肤成纤维细胞MMP-1和MMP-3表达的抑制作用。结果显示,单纯用UVB照射人成纤维细胞后可促进IκBα的降解,增加p50和p65亚基在细胞核的定位以及NF-κB与DNA结合的活性,提示UVB可以显著提高NF-κB的活性。而分别用虫草素和威灵仙提取物预处理后能够完全阻断UVB诱导的NF-κB的活化,以及抑制UVB诱导的MMP-1和MMP-3 mRNA和蛋白的表达。提示虫草素和威灵仙提取物可通过拮抗NF-κB通路以抑制MMPs的表达。
　　木兰提取物及其有效成分木兰醇(magnolol)能够通过抑制NF-κB通路达到抗光老化的作用。Tanaka等[16]用木兰提取物涂抹在小鼠皮肤后发现其能防止皮肤光老化过程中的角质形成细胞过度增殖和胶原纤维降解。进一步研究发现木兰提取物还能抑制NF-κB介导的基因表达。经鉴定,木兰醇即为木兰提取物的有效活性成分。单用木兰醇后便能有效抑制活化的NF-κB的核转位以及NF-κB依赖的基因转录,但对IκBα的磷酸化或者降解没有影响。另外,木兰醇能有效抑制过度表达p65的细胞产生MMP-1。
　　小白菊内酯(parthenolide)是欧洲小白菊的有效成分。体外研究表明它能够抑制IKK,并直接使NF-κB灭活。Tanaka 等[17]研究发现,小白菊内酯能够有效抑制UVB介导的NF-κB基因表达,抑制过度表达p65亚基的细胞产生MMP-1,以及抑制小鼠皮肤UVB诱导的角质形成细胞和黑素细胞的增殖。这些发现提示小白菊内酯可通过抑制NF-κB达到抗光老化的作用。
　　2.4 以多个环节为靶点的MMPs抑制剂:UV诱导MMPs上调是多因素、多阶段的过程。因此,MMPs抑制剂也可以是多环节、多靶点作用的结果。如表没食子儿茶素没食子酸酯等化合物可以通过抑制ROS的产生、MAPK通路等多个环节达到抑制MMPs表达的作用。表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体,是绿茶中主要的也是最有效的化学光保护剂。EGCG可通过抑制UV介导的ROS的产生、RNS的产生、NF-κB通路和MAPK通路这四个环节抑制MMPs表达,显著抑制UVB照射人皮肤成纤维细胞导致的胶原蛋白降解[18]:①抑制ROS的产生:EGCG是有效的抗氧化剂,能有效减少或清除H2O2等ROS,其抗氧化能力比维生素C和维生素E甚至高出数倍;②抑制RNS的产生:UVB辐射HaCaT细胞可促进诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达和一氧化氮(NO)的产生,EGCG处理细胞后能够逆转上述变化。在人皮肤中,EGCG能减少UV诱导的氧化亚氮的产生;③抑制MAPK通路:EGCC能快速阻断UVB辐射诱导的MAPK、JNK、p38MAPK和ERK1/2的磷酸化以抑制UVB诱导的MMP-1、MMP-8和MMP-13的表达。另外,EGCG能抑制UVB辐射HaCaT细胞引起的c-fos基因转录激活及c-fos 蛋白蓄积。因此,EGCG能够通过干扰MAPK通路抑制MMPs的产生;④抑制NF-κB通路:UVB能介导NF-κB的抑制因子IκBα的降解与磷酸化以及介导IKKα的激活,而EGCG则能剂量依赖性地抑制UVB诱导的上述改变。另外,EGCG可抑制UVB介导的NF-κB/p65的激活和核转位,以及抑制NF-κB与NF-κB启动子结合的能力。
　　沼泽蓝莓花青素可通过抑制UVB介导的ROS的产生、NF-κB通路和MAPK通路而抑制MMPs表达。Bae等[19]研究了从可食用的沼泽蓝莓提取的花青素类(ATH-BBe)对UVB辐射人皮肤成纤维细胞的光保护作用。结果显示ATH-BBe能减轻UVB诱导的毒性作用、ROS的产生、DNA损伤,以及减少MMPs的产生而显著抑制胶原蛋白的降解。另外,ATH-BBe能减少UVB诱导的前胶原蛋白转录的下调以及逆转NF-κB的核转位。UVB辐射能快速活化JNK的ASK-1信号通路以及p38MAPK,而ATH-BBe能抑制c-Jun、p53的磷酸化以及STAT-1的活化,而这些分子均与MAPK信号通路有关。这些结果显示ATH-BBe能通过调节ROS的产生、NF-κB和MAPK信号通路减少UVB触发的胶原蛋白破坏。因此,ATH-BBe可能对UV诱导的皮肤光老化具有保护作用。
　　黄酮类化合物(flavonoids)可通过抑制ROS的产生、MAPK通路而抑制MMPs表达。黄酮类化合物是一类广泛分布于植物界的天然抗氧化剂。大量的研究表明,黄酮类化合物可降低细胞内的活性氧水平。Lim 等[20]首次研究了天然的黄酮类化合物(包括槲皮素、山柰酚、芹黄素和汉黄芩)的抗光老化作用。这些化合物能够通过抑制AP-1的活化而抑制MMP-1的活性及MMP-1的表达。而且,槲皮素能抑制ERK和p38MAPK活化,山柰酚能够抑制p38MAPK和JNK的活化。然而,不同的黄酮类化合物由于化学结构的不同而表现出不完全相同的抗氧化和抗光老化作用。如槲皮素、山柰酚能够显著抑制重组人MMP-1的活性,而芹黄素和汉黄芩素只有较弱的抑制活性。
　　
　　3小结
　　综上所述,UV照射可通过激活复杂的信号通路诱导MMPs的活化,进而降解真皮细胞外基质成分导致皮肤光老化,因此阻断这些信号通路的始动环节或者关键环节便能抑制MMPs活化达到抗光老化的作用。近年来,MMPs被认为是一个有前景的抗光老化治疗靶点。研发有效的MMPs抑制剂是一个重要的研究热点。到目前为止,已经有大量来自于天然生物的MMPs抑制剂被研究开发。另外,以有关通路中关键环节为靶点结合现代生物学技术设计的抑制剂,其抗光老化作用将更加特异、高效。例如:NF-κB寡聚脱氧核苷酸,它是利用寡核苷酸技术设计的一种新型MMPs抑制剂[21],该抑制剂可以阻断NF-κB与MMPs启动子结合而抑制MMPs的表达,达到抗光老化的作用。然而这些MMPs抑制剂能否应用于抗老化的预防和治疗仍需大量深入的研究。
　　
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　　[收稿日期]2010-05-06[修回日期]2010-06-28
　　编辑/李阳利