整形外科 组织工程与整形外科的研究进展

　　随着人口的增加，以治疗疾病或替代损伤器官为主的生物医学负担仍然继续加重。仅在美国，每年慢性疾病的医疗费用就超过1.5万亿美元，但其中的患者仍有70%死亡，每年有超过10万余人等待器官移植[1]，其中主要原因就是生物材料缺乏和不足。利用组织工程材料修复和重建正常组织的缺损和畸形一直以来都是整形外科工作者感兴趣的问题。现在人们不仅希望组织工程可以替换原器官，更期望可以恢复其生理功能,有关这方面的研究也在过去数十年得到了长足的进步[2]。本文则简要概述组织工程在整形外科的应用，并对这一领域进行了展望。
　　
　　1基本原则
　　“组织工程”一词已经出现了二十多年，组织工程学是综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外预先构建一个有生物活性的假体，然后置入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的部分或全部功能，或作为一种体外成分，暂时替代器官部分功能，达到提高生活质量，延长生命活动的目的[3]。尽管随着生命科学的进步，组织工程得到了巨大进步，但Langer和Vacanti于1993年提出的组织工程中的三个基本方法至今仍具有现实意义[4]。
　　实施组织工程的主要过程包括：①通过组织活检获得种子细胞，并采用体外分离、培养、纯化、扩增和传代的方法，得到足够数量的细胞；②将种子细胞接种到一种生物相容性良好的支架上，形成细胞支架复合物；③将复合物置入人体，使支架材料逐渐被机体降解吸收，而种子细胞增殖分化取代原有的组织器官。由此可见，足量种子细胞的获取、支架材料的选择及参与细胞增殖分化的诱导和调控的细胞因子的应用，便成为组织工程的三大主要环节。
　　1.1 种子细胞的获取： 包括鉴别和分离出选定的具有增殖和修复、再生功能的细胞群。并采用体外分离、培养、纯化、扩增和传代的方法，得到足够数量的细胞。组织工程使用的细胞多为干细胞，即具有全能性、可自我更新的细胞。目前，在人一生的各个阶段和几乎所有的成年组织都已经发现了干细胞的存在[5]。研究比较多的干细胞包括：
　　1.1.1 胚胎干细胞：是一些来源于囊胚内细胞团的细胞，具有最大潜能，可分化为三个胚层[6]。但对它的应用，却因伦理道德、移植后的免疫原性等方面的问题而受到限制。
　　1.1.2 间充质干细胞：是可以分化成中胚层的多能祖细胞。可最终分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉和血管等组织[7]。组织重建时的祖细胞也大多来自这些组织中。
　　1.1.3 造血干细胞：可以分化产生血液系统中的各种细胞及参与血管形成的内皮祖细胞。
　　1.1.4 组织特异性干细胞：也已在皮肤、肌肉、心脏、脑等处发现。最近，研究人员已经利用基因诱导技术将成年人的细胞诱导成具有类似干细胞功能的多能细胞。而且对于这些“去分化”细胞的使用，不涉及伦理道德问题的限制。不过，这项新技术还需要更进一步的研究才能应用于临床[8]。
　　1.2 细胞增殖分化的诱导和调控:干细胞的诱导分化需要在特定的化学环境和外界环境中才能实现，目前，对于分离细胞的生物化学环境控制的研究已经有了很大进展，调节细胞行为的许多生长因子和合成小分子的浓度、空间结构和时间相关性等都已经确定。纳米粒子传递和控释微球作为通过病毒性和非病毒载体的药物运输系统,和基因转移已被用于概括组织形态发生发展的环境[9]。
　　1.3 支架材料:支架材料在组织工程研究中起着中心作用，随着材料编织技术、生物力学技术、三维打印技术、影像学技术、计算机模拟技术以及生物反应器技术等各种现代技术的应用，它不仅为特定的细胞提供结构支撑，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构[10]。作为组织工程支架材料，必须具有三维多孔性及足够的孔隙率，以便给种子细胞的种植和初始分裂提供足够的空间。除此之外，组织工程的支架材料需要给组织发生提供一个细胞外环境，如：良好的生物相容性、降解速率的可调控性和良好的可塑性等。目前的支架材料主要有天然的支架材料、人工合成的支架材料以及复合材料。不过，由于天然替代品有限，合成生物材料越来越多地被用于高分子可降解支架的制造[11]。
　　组织工程中的这三个元素也可以说是一种“种子和土壤”的关系，它包括了机械力、支架结构、细胞因子、氧张力等非细胞因素（即土壤）对干细胞、间质细胞和内皮细胞这些“种子”的影响。在组织、器官的生成过程中能够充分培养一个再生的环境时需要良好的种子细胞和周围环境。
　　
　　2特定的组织工程
　　目前,国际上把组织工程产品大致分为四类：细胞类(如干细胞、治疗性克隆、微囊化细胞治疗)、代谢类(如生物人工肝、生物人工肾、生物人工胰腺)、结构类(如皮肤、心血管、骨骼肌)，以及其他类型。比较成熟的产品有组织工程皮肤，并在临床获得应用和组织工程软骨。
　　2.1 皮肤:传统的组织工程皮肤的制作方法是将角质形成细胞和/或成纤维细胞在天然或合成真皮支架上接种[4]。尽管根据这种方法已经制作出几种商业化的组织工程皮肤，但他们的长期临床效果一直因为没有自身的祖细胞而欠佳。在毛囊、滤泡间细胞区域以及皮脂腺等处已发现存在许多皮肤干细胞，人们也已经认识到这些细胞对皮肤稳态的作用。基因治疗也展示出对各种遗传性皮肤病治疗的可能，同时还可增加皮肤的再生能力[12]。近些年，已经利用人的脂肪干细胞生产出含有表皮、真皮、皮下组织的皮肤，并诱导出多能干细胞[13]。该研究说明，皮肤细胞组织可以分化成为各种组织类型。尽管取得了这些可喜的研究成果，但再生出具有完整功能的皮肤仍有很长的路要走。角质形成细胞和成纤维细胞之间的复杂旁分泌关系刚刚被人们认识，他们和许多其他皮肤的物质通过产生如机械感觉、体温调节及色素生成等重要功能来维持皮肤的稳态[14]。同时，细胞外基质是如何通过复杂的机制调节皮肤细胞的活性而产生可替代的皮肤，还需要进一步研究。随着日益多样化的细胞群和生化信号研究，未来的组织工程皮肤很可能继续采用在基质上种植种子的方法。虽然，在关于皮肤的物理功能方面研究取得了很多进展，但如何使皮肤产生众多功能特性仍是组织工程学中令人感兴趣的问题。
　　2.2 脂肪：目前用于软组织重建的方法是自体组织移植和人造埋植剂，但是却受到组织吸收、埋植剂破裂或挛缩等多种问题的限制[15]。然而，组织工程脂肪通过在具有生物相容性的支架上接种脂肪祖细胞解决了这些问题。由于成熟的脂肪细胞增殖能力有限，最常用的细胞为前脂肪细胞和来自供体的脂肪组织和骨髓中的间充质干细胞。脂肪抽吸术和皮下脂肪切取术均可获取足够量的脂肪颗粒悬液或脂肪组织。因其含有大量的脂肪干细胞而在未来有较好前景。
　　除了移植后不易建立血运，这一组织工程共同难题外，组织工程脂肪还面临着外形和体积不稳定的困难[16]。这方面接种干细胞的支架显示出良好的优势，研究发现植入脂肪后可使其维持原形状达4周[17]。将脂肪来源的干细胞添加到抽出的脂肪后再进行脂肪移植，可以提高在大鼠模型上的组织存活率和血液供应形成率，最近此技术用来以较少的剂量增加人类乳腺癌组织[18]。未来临床应用的成功，将取决于精炼干细胞的获取、分离技术和诱发脂肪的生物材料持久性的研究进展。而且，由于脂肪干细胞的含量多、来源广、多能的特点，预计将有越来越多的脂肪干细胞用来重建和形成其他间叶组织，如骨骼、肌肉、软骨等。此外，它易建立血运，可塑性强，使其在未来广泛地用于构建更为复杂的多组织结构成为可能。
　　2.3 骨骼肌：除了普遍存在的细胞-基质的作用机制之外，组织工程肌肉还面临着复杂的微电子机械系统和机械网状结构的挑战。直接注射供体的成肌细胞由于受多种限制而不能成功，最新的进展是将成肌细胞或肌干细胞接种到组织工程支架上，在支架上采用机械刺激和电刺激提高他们分化为肌细胞的潜能[19]，增加骨骼肌功能的复杂性。为了增加组织工程肌肉中血管形成，研究人员在体外使用成肌细胞、胚胎成纤维细胞、内皮细胞的多元化体系，使组织工程肌肉提前形成血管。然后将这种骨骼肌结构植入免疫缺陷的老鼠体内，其整合、存活和血运建立的结果均优于不含这三种细胞的对照组[20]。这也同样说明，成肌细胞附着于支架上后在体内分化成为骨骼肌的效果优于直接将其注入体内。
　　2.4 软骨:软骨是一种缺乏血供并且有与生俱来的自我修复机制的特殊组织。成熟的软骨细胞在体外增殖能力和表型可变性都受到限制，因此目前的软骨组织工程战略侧重于利用间充质干细胞和软骨祖细胞[21]。这两种细胞均可使成纤维细胞脱分化，通过基因增强软骨再生能力的实验已处于临床前阶段[22]。在体外利用接种多种种子细胞的支架已开发出仿生软骨结构，植入到免疫抑制的小鼠体内后发现形成新软骨[23]。目前，第一个生物工程软骨已经用于治疗4例小耳畸形患者，从耳残余部获取软骨细胞，在体外培养、传代后植入下腹部，使其扩大、生长成熟。形成的软骨组织在6个月后取出雕塑成耳的形状，在术后2～5年随访过程中未出现组织吸收的现象[24]。
　　2.5 骨：尽管在组织工程骨的探索道路上有了很多尝试，但是如何组合出最合适的种子细胞、支架材料和诱导信号以形成最好的组织工程骨还没有解决。尽管许多细胞都表现出成骨潜能，如成骨细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、骨骼细胞，但最有效的细胞类型仍然未知。最近，在一项关于成年和胎儿干细胞成骨能力对比的研究显示，两者在急性股骨损伤的裸鼠模型上成骨能力无明显差异。另一组在体外的模型实验中证明，成骨细胞植于支架之前可以被分化前期的间充质干细胞增强其分化作用[25]。此外，他们还报道了生物反应器系统的改良成果，强调了在促进骨形成时环境信号作用的重要性。
　　2001年，第1例自体骨髓来源的间充质干细胞用于修复大的骨缺陷之后，另一个小组报道了使用含骨质块、骨形态发生蛋白7（BMP-7）和自体骨髓细胞的钛支架采用二期手术方式修复了一个下颌骨缺损的病例[26]。将设计好的支架首先置入患者的背阔肌(来当做原位诱导成骨生物反应器）7周以后利用自由皮瓣来修补颌骨缺损。然而，大规模临床研究前，还需要继续调查确定最合适的细胞、支架、生物工程和分子信号的组合来获得最佳的生物工程骨。
　　2.6 血管：血管移植在重建手术中经常被用到，用于重建的血管主要有以下几种：①自体同源移植，这类材料经常因为供体不健康导致的病态而不可用，且费用昂贵；②人工材料移植，这类材料容易形成栓塞，生长潜力和耐久性都比较差。基于干细胞的应用已经被用在血管构造上，包括使用胚胎干细胞构造小口径血管（直径＜6mm）以及使用原始内皮细胞、间充质干细胞来依次构造内皮层和肌纤维层[27]。基于细胞层的血管设计实现了完全自体同源的三层式血管的构造，第1例生物工程血管用于构建1例4岁女孩肺动脉的临床试验中[28]。血管生物反应器很好地调控了血管生成中关键的机械信号和生理信号，同时在“连接动静脉的腔室循环模型”的体外生物反应器中产生了血管化。另外，对于小口径人造血管远期通畅率不高的问题，我们科室正在尝试用脂肪干细胞和血管内皮细胞在血流冲击下制作小口径血管来解决这个问题。
　　2.7 周围神经:治疗神经缺陷的替换选择有自体同源移植（受限于供源稀少、供体不健康，易发神经瘤和供受体不匹配），异源移植（受限于免疫排异反应）以及非细胞材料移植（受限于再生延迟）。组织工程技术战略有希望将原始神经细胞、生长因子和其他生物材料合成，产生一种可行的替代品[29]。遍布全身的神经细胞表现出良好的可塑性，而且使用Schwann细胞和间充质干细胞的治疗方法已经在体外和动物试验中取得了成功[30]。基因治疗已经表现出较大成功的可能，通过促进神经因子的过表达，加强神经再生的方法，但是在功能恢复的持久改善和病毒介导载体的基因传递的长期结果还是未知的[31]。与其他复杂组织一样，神经缺损的修复也需要结构和生化的信号精确协调，才能使神经的生长最终恢复功能。
　　
　　3展望
　　一直以来，组织工程的组织和器官在整形外科领域发挥着不可或缺的角色。尽管在组织工程领域取得了很多进展，但应用于临床仍然有很多困难。许多涉及材料学、生物学、医学、生物力学的基本问题及基本现象还没有搞清楚，例如：细胞在工程化基质中如何实现功能、干细胞来源的产业化、生物力学在组织构建过程中的具体作用及机理、细胞外基质化可降解的支架材料等。另外，大器官的重建也仍旧受到血供有限的限制。这些问题都值得整形外科的工作者去思考和探究。
　　
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　　[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-16
　　编辑/李阳利