Ｌ－选择素单克隆抗体对缺血／再灌注损伤皮瓣的保护作用:缺血再灌注损伤

　　[摘要]目的：探讨L－选择素单克隆抗体在缺血／再灌注损伤皮瓣中的作用。方法：在大鼠缺血／再灌注损伤皮瓣模型，分别应用L－选择素单克隆抗体观察皮瓣成活面积及组织改变。结果：术后7天时皮瓣成活面积分别为：假性实验组为100％；生理盐水对照组为(18.3±19.6)％；实验组为(85.63±22.05)％。组织学观察发现：生理盐水对照组有大量的炎细胞浸润、组织肿胀、大部分皮肤组织坏死；L－选择素单克隆抗体使用实验组则炎症症状明显减轻、坏死组织减少，基本与假性实验组近似。结论：L－选择素单克隆抗体可以明显减轻缺血／再灌注损伤，从而提高缺血／再灌注损伤皮瓣成活面积。
　　[关键词]缺血／再灌注损伤；皮瓣；L－选择素单克隆抗体
　　[中图分类号]R622　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)05－0593－03
　　
　　缺血／再灌注损伤(I/R)是对于曾经发生过缺血的组织，重新开放血流时，组织的缺血状态不但没有改善，反而更加加重，此乃缺血／再灌注损伤的主要特征。由于其发病机制复杂，尚不十分清楚，因而成为很多学者关注的热点。目前已有资料表明：能量代谢异常、氧自由基产生增加、钙离子超负荷等在其损伤中起着重要作用。近年来的研究发现中性粒细胞在缺血／再灌注损伤中发挥着极为重要的作用，而L－选择素是调节这种作用的关键因素，本实验使用L－选择素单克隆抗体，来观察对缺血／再灌注损伤皮瓣的保护作用。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1.1　实验材料：动物分组：36只Sprague－Dawley雄性大鼠(日本昭和大学医学部动物中心提供)，体重225～250g，分三组，分别为假性实验组、生理盐水对照组及实验组(L－选择素单克隆抗体使用组)动物，每组各12只。
　　
　　1.2　模型制备：于大鼠腹部制备35mm×45mm腹壁浅血管岛状皮瓣，用显微外科用的静脉夹阻断股动静脉(因腹壁浅动静脉较细小，钳夹时损伤较大，故阻断分出腹壁浅血管前的股血管即可)，9h后去除血管夹开放血流，形成缺血／再灌注损伤皮瓣模型。而假性实验组只掀起皮瓣而未阻断血管形成缺血改变。
　　
　　1.3　抗体使用：再灌注前15min，L－选择素单克隆抗体0.20mg/kg，稀释至0.5ml。而对照组则给予生理盐水O.5ml，均由尾静脉注入。
　　
　　1.4　观察内容
　　1.4.1　皮瓣成活面积：术后7天观察的成活面积，硫酸纸描绘出成活与坏死的面积，摄像机拍摄后用图像采集卡输入计算机，用自编的程序测算皮瓣成活与坏死的面积占整个皮瓣的百分数，表示为：皮瓣成活率(％)＝[皮瓣成活面积(cm2)／整个皮瓣面积(cm2)]×100。
　　
　　1.4.2　组织学观察：术后7天切取整个皮瓣，用10％甲醛固定、切片、HE染色，行组织病理学观察。
　　
　　1.5　统计学分析：所有结果均用x±s表示，皮瓣成活面积用SAS统计软件进行t检验分析
　　
　　2　结果
　　　2.1　皮瓣成活面积：假性实验组皮瓣无坏死，生理盐水对照组开放后皮瓣颜色差，而注射了L－选择素单克隆抗体的皮瓣在血流开放后约1min就能看到皮瓣的颜色有明显的改善；l周时皮瓣的成活面积：假性实验组为100％；生理盐水对照组为(18.3±19.6)％；实验组为(85.63±22.05)％。两组间有显著性差异(P＜0.01)。
　　
　　2.2　组织学观察：假性实验组组织结构正常、无异常表现；而生理盐水对照组有大量的炎细胞浸润、组织肿胀、部分皮肤组织坏死，失去正常的组织结构；而L－选择素单克隆抗体使用实验组则炎症症状明显减轻、坏死组织减少，基本与假性实验组近似。
　　
　　3　讨论
　　
　　缺血／再灌注损伤的主要原因之一，与白细胞导致的缺血组织的损伤、以及与血管内皮细胞的粘附有关。中性粒细胞进入缺血组织后被激活，释放大量毒性氧自由基和蛋白水解酶，致血管通透性增加、组织水肿等一系列病理变化；同时被激活的白细胞粘附于血管内皮，主要在毛细血管前括约肌和后微静脉引起损伤，不能通过毛细胞血管前括约肌的白细胞发生堆积、阻塞毛细血管、加重缺血损伤。
　　选择素是由在氨基酸末端的钙离子依赖的凝血素区、类上皮生长因子区、补体调节蛋白中发现的重复区、跨膜区和胞浆尾区所组成，分为E－、P－、L－选择素三个成员。L－选择素广泛表达于多种白细胞，包括中性粒细胞、单核细胞、血液和骨髓中的大部分T、B细胞及一部分自然杀伤细胞。研究表明，L－选择素成簇地存在于静止的中性粒细胞微绒毛顶端或膜的皱褶部位，这可能有利于L选择素与其内皮细胞配体的及早接触。与另外二种选择素不同，即使没有受到刺激，白细胞表面也有表达，其配体为活性化血管内皮细胞上的糖基化依赖性细胞粘附分子(GlyCAM－1)。
　　实验证明，L－选择素在白细胞的移出与移行中发挥重要作用，主要是通过其与其配体的结合实现的。L－选择素是白细胞“滚动受体”，白细胞滚动是白细胞与内皮细胞牢固粘附的先决条件。在感染及炎症反应过程中，炎症介质首先活化血管内皮细胞，使其表达粘附分子相应的配体，血流中的白细胞通过表面表达的L－选择素与其相应的内皮细胞配体结合，使随机运动的白细胞在切应力的作用下沿炎症附近血管(特别是毛细血管后静脉)内皮缓慢滚动，而后随着L－选择素介导的细胞信号传导的白细胞激活和β2整合素的粘附加强作用，使白细胞活化、变形，穿越血管内皮细胞到血管外，移行到炎症区域释放炎症介质介导炎性反应。
　　Von Andrian等研究发现,L－选择素单抗DREG56可明显抑制PMN滚动，而β2－整合素或免疫球蛋白超家庭成员的单抗则只阻断PMN的牢固粘附，不影响滚动；不表达L－选择素的小鼠前B淋巴细胞瘤株L122几乎不能在炎性静脉内皮上滚动，但转染人L－选择素后，其滚动能力明显增强，且与L－选择素表达的密度呈正相关；抑制L－选择素功能，便抑制了滚动，也就抑制了白细胞的渗出。因此，阻断L－选择素与其内皮配体的作用己成为抗炎研究的新途径。Jutila等全身应用L－选择素单抗(MEL214)使小鼠炎性腹腔中PMN的渗出减少了70％，引起白细胞的积聚减少。Watson等在巯基醋酸性腹膜炎模型上用可溶性L－选择素／IgG嵌合分子也抑制了75％的PMN渗出。
　　特异性选择素分子的单克隆抗体在缺血／再灌注损伤(I/R)中的研究最为广泛。在猫心肌缺血再灌注损伤模型中应用抗L－选择素抗体，发现能显著减少再灌注后坏死心肌面积，稳定EC功能，并防止PMN的过度激活。在小鼠模型中，L－选择素单抗可以预防机械正压通气引起的肺损伤。在哮喘和慢性阻塞性肺病等慢性炎症性疾病的发病早期，选择素介导的白细胞－内皮细胞的粘附是重要的病理过程，采用L－选择素的单抗来对抗这一病理过程，能达到治疗效果。因此，L－选择素单抗有可能用于预防和治疗炎性疾病。近来的研究证明，使用L－选择素抗体进行治疗，不会造成白细胞减少症，也不会增加感染或败血症等并发症的发生率，因此其使用是安全可靠的。
　　本实验研究发现，阻断腹壁浅动静脉岛状皮瓣血流9h再灌注后可诱导出缺血／再灌注损伤，一周时皮瓣部分或全部坏死，组织学观察发现组织肿胀、炎细胞浸润。而使用L－选择素单克隆抗体后，皮瓣成活率提高，组织肿胀减轻、坏死组织减少、炎细胞浸润降低。进一步证实L－选择素在白细胞与内皮细胞粘附中的作用，使用相应的特异性抗体可以减轻缺血／再灌注损伤程度。在皮瓣缺血早期阻断L－选择素的表达可能有助于减轻缺血性损伤。为临床防治撕脱性皮瓣原位缝合后继发坏死提供一个新途径。
　　
　　编辑　张惠娟
　　
　　基金项目：陕西省攻关计划项目资助　[编号：2005K12－G5(13)]