先天性小耳畸形家系收集和遗传学研究 精子畸形试验的遗传学终点

　　[摘要]目的：收集和利用先天性小耳畸形家系资源进行相关的遗传学研究。方法：通过对住院患者及其家属家族史的询问调查，收集先天性小耳畸形家系；利用收集的家系资源进行先证者核型分析和vrkl基因突变检测。 结果：于2005年9月～2007年3月，收集先天性小耳畸形家系7个；对7个家系先讧者的核型分析和vrkl基因突变检测均未发现异常。 结论：先天性小耳畸形家系核型正常，初步排除了vrk1基因在先天性小耳畸形发病中的作用。
　　[关键词]先天性小耳畸形；家系；遗传学研究
　　
　　先天性小耳畸形是继唇、腭裂之后最为常见的面部畸形，也是导致面部不对称的最常见先天性畸形。先天性小耳畸形病因尚不明确，遗传是发病因素之一，家系是研究遗传因素的重要资源。我们于2005年9月～2007年3月，通过对中国医学科学院整形外科医院住院患者及其家属家族史的询问调查，收集了先天性小耳畸形家系7个，并进行了相关的遗传学研究。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　家系收集
　　1．1．1　先证者一级亲属中(包括父母、同胞及子代)至少有一人为先天性小耳畸形患者，即家系中至少两人为先天性小耳畸形患者；对于所有接受检查的家系成员告知对本研究的知情，并在自愿的情况下签写知情同意书。
　　1．1．2　从先证者出发，追溯家庭成员的亲缘关系，应用Cyrillic2.1软件绘制家系图谱。
　　1．1．3　对于签写知情同意书的人员抽取外周血约5ml，用于进行细胞遗传学检测和制备DNA。
　　
　　1．2　染色体显带检测
　　1．2．1　细胞培养：取0.3ml肝素钠抗凝静脉全血接种于15％小牛血清、适量抗生素和PHA的RPMll640培养基中，放37℃恒温箱中培养，至36h后加入终浓度为7.3×10mol／ml的秋水仙素，继续培养至48h。
　　1．2．2　染色体制备：用0.075mol／L的Kcl低渗处理两次，每次10min，3:1甲醇、冰醋酸固定，第1次10min，第2次15～20min，空气干燥制片。
　　1．2．3　G显带：将制备出的标本放于37℃恒温箱中5～7天，然后用0.025％的胰酶37℃条件下处理15～20s，8％Giemsa常温下染色20min后镜检。
　　
　　1．3　vrk1基因突变筛查
　　1．3．1　外周血DNA的提取：常规苯酚、氯仿抽提DNA。
　　1．3．2　PCR反应：vrkl基因设计引物覆盖了vrkl所有编码区和外显子和内含子交界处的引物11对(外显子1为非编码区故未设计引物检测)。应用25μ1的PCR反应体系，包含基因组DNA0.5μ1，5U／μ1Ampli Taq polymerase0.5μ1，10xPCR缓冲液2.5μ1，10mmol／L dNTPs1μ1，primer0.5μ1，双蒸去离子水补足致25μ1。PCR反应条件如下：95℃预变性15min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 55s，10个循环；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，22个循环；72℃充分延伸5min；4℃保存。取2μ1PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。
　　1．3．3　测序：PCR产物经纯化回收后，进行双向DNA测序，测序由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司完成。将测序结果与基因库中的正常序列进行对比分析。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　先天性小耳畸形家系收集：我们共收集了7个先天性小耳畸形家系。
　　
　　2．2　染色体核型检测：对7个家系的先证者(5男2女)经过染色体显带技术的检查，结果核型正常，为46XY或46XX，且未发现有染色体的异常。
　　
　　2．3　vrk1基因突变检测：对7个家系先证者的vrk1基因检测未发现存在基因突变。
　　
　　3　讨论
　　
　　家系在遗传因素的研究中具有重要作用。目前业内普遍认为，找到某一复杂性状相似呈单基因遗传的家系，是克隆复杂性状的相关基因的最佳途径。正是如此，国内外学者以及国内外较高级别的研究资助机构普遍认同一个观点：找到大家系，即找到人类遗传的全部所在。疾病家系就是“基因资源”，成为各国保护和争夺的对象。我国是一个拥有丰富的先天性小耳畸形病种资源的大国，因此，保护、利用和研究我国宝贵的遗传家系是迫在眉睫的工作。
　　我们利用收集的家系进行了细胞遗传学和分子遗传学检测。绝大多数先天性小耳畸形的染色体核型检测是正常的，但少数患者出现染色体畸形，目前报道的包括：5p染色体缺失，6q单体性染色体，8q染色体缺失，18三体，21环状染色体，22q缺失，22三体，47XXY。除此以外，还有报道染色体镶嵌现象，包括7三体镶嵌，9三体镶嵌。我们针对收集的7个家系的先证者进行的染色体核型检测未发现核型和染色体的异常。
　　侯选基因(candidate gene approach)结合基因定位的方法进行分子遗传学研究，是近几年随着人类疾病基因研究的进展而发展起来的一种基因鉴定的方法，是根据某种遗传病和特定基因分别定位于染色体的同一区域，而发现并鉴定其基因突变，由此定位和克隆基因；也可从疾病的表型出发，选取表型相似的已知基因，对其突变进行检测，研究其致病基因。如在分子遗传学研究中能够灵活运用候选基因法，可能会获得意想不到的成果。
　　Kelberman等收集了半侧颜面短小(hemifa cial microsomia)家系，首次通过全基因组扫描、连锁分析的方法将其致病基因定位于14q21，位于微卫星标记物D14S987、D14S65之间约为10.7厘摩的区域。先天性小耳畸形可以看作半侧颜面短小的微小表现形式(microform)，因此我们通过http：／／genome.UCSC.edu，查询微卫星标记物D14S987和D14S65之间的基因及其功能，共寻找到7个知名基因，通过对这些基因功能的分析，我们选择对细胞凋亡起重要调节作用的基因，并且在软组织、软骨和骨髂组织都有表达的基因作为候选基因，符合以上条件的基因首选vrk1(vaccinia re－lated kinase 1)。但通过对于7个先天性小耳畸形家系先证者的基因检测，初步排除了vrkl基因突变。
　　微卫星标记物D14S987和D14S65之间还存在6个知名基因：BDKRBI(bradykiMn receptor BJ)，BDKRB2(bradv，kinin receptor B2)，AK7(adeny－late kinase 7)，C14orfl03(chromosome 14 openreading frame 103)，C14orfl29(chromosome 14open reading frame 129)和PAPOLA(polv(A)polymerase alpha)，因此进一步针对这些基因进行突变检测是我们将要继续开展的研究。但应当了解随着基因克隆和鉴定技术的完善，微卫星标记物D14S987和D14S65可能还会有新的基因作为候选基因出现，这将增加先天性小耳畸形致病基因鉴定的难度，但相信随着研究的深入进展，必将能够揭开先天性小耳畸形神秘的面纱。