他克莫司能修复皮肤吗 他克莫司预防兔耳瘢痕增生的实验研究

　　[摘要]目的：研究他克莫司对兔耳瘢痕增生的影响。方法：选10只新西兰白兔雌雄各半，按本研究组建立的改良方法制作兔耳瘢痕模型，左耳为空白对照组涂凡士林软膏，右耳为实验组涂他克莫司软膏。伤后14天、21天、28天、35天及49天采集标本，行苏木精-伊红（HE）及Masson三色法染色，统计成纤维细胞密度，实时定量PCR（Real-time PCR）检测细胞外基质成分I型胶原（collagen I；Col I）和纤维连接蛋白（fibronectin；Fn），CD4+ 辅助性T细胞-2（Th2）产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的重要基因巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor；M-CSF）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα；TNF-α）的表达。结果：HE及Masson三色法染色可见实验组较对照组胶原沉积明显减少，PCR结果可见ColI、Fn、IL-4、M-CSF和TNF-α在实验组中的表达较对照组在各时间点均减少。结论：应用他克莫司可通过下调IL-4、M-CSF和TNF-α的表达来抑制兔耳瘢痕增生。
　　[关键词]瘢痕；免疫；他克莫司
　　[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0756-04
　　
　　Preventive effects of Tacrolimus on the rabbit ear hypertrophic scar model
　　HAN Xiao-xia,ZENG Hai-feng,DIAO Jian-sheng,GUO Shu-zhong,XIA Wei
　　(Institute of Plastic Surgery,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University, Xi"an710032，Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo evaluate the preventive effect of tacrolimus on rabbit ear hypertrophic scar formation.MethodsTen New Zealand White rabbits were employed in this study. Ventral ear hypertrophic scar model was created according to our previous report. Experimental group contains all the right ear wounds and treated with tacrolimus ointment. The control group contains all the left ear wounds and treated with vaseline ointment. Both the groups were harvested on days 14, 21, 28, 35 and 49 post wounding. Hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome staining were performed to reveal differences in scar morphology. Real-time PCR was adopted to evaluate the expression of ColI, Fn, IL-4, M-CSF and TNF-α.ResultsThe morphology had a large difference in the two groups. Compared with the control group, the fibroblast number in the treated group was significantly reduced (P 　　1.3.2 术后第14、21、28、35及49天取材，随机处死2只兔子，沿创面边缘扩大0.5cm环行切取瘢痕组织。每个标本沿垂直于瘢痕最凸起点处纵行切开，分为两半，其中一半即刻以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，行苏木素-伊红（HE）染色，在400倍光镜下观察HE 染色切片，每张切片于真皮层随机选取5个视野，统计单位面积内成纤维细胞的密度；另一半提取mRNA行PCR检测。
　　1.3.2.1 Masson三色染色，在40倍光镜下观察Masson三色染色切片。
　　1.3.2.2 Real-time PCR检测细胞外基质成分ColI和Fn，Th2产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的重要基因M-CSF和TNF-α的表达。引物由上海生工合成，设计如表1所示，Tm值设定为60℃。将各时间点瘢痕标本，提取RNA，反转录为cDNA，进行Real-time PCR的检测。采用SYBR GreenⅡ染料在MJ Research Option 2荧光定量PCR仪上检测目的基因的表达。Real-time PCR反应体系20μL。PCR反应条件：激活95℃，10min；40循环，变性95 ℃，30 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，60 s。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃，1 min，50℃，1 min，以0.10℃/s的速度升温到95 ℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行2次Real-time PCR检测，取平均值。对cDNA模板进行倍比稀释，以2X,1X,0.5X,0.25X四个浓度梯度的cDNA模板进行Real-time PCR扩增。将不同浓度模板的对数和相应到达阈值的循环数（Ct）值作图，做标准曲线。基因mRNA表达采用直线相关回归分析，GAPDH的表达量作为内参照，分析目的基因的相对表达量。
　　1.3.3 实验结果均以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.5软件进行t检验处理数据，P