趋化素样因子超家族成员1基因表达与冠心病发生风险的相关性及相关机制研究

齐贵彬,高建步,张明磊,张永杰,王 星,董晓双

(河南大学附属南阳市中心医院 心血管内科,河南 南阳473009)

动脉粥样硬化是冠心病发生的主要病理基础，相关研究认为，动脉粥样硬化是以单核细胞浸润为主要特征的动脉壁慢性炎性疾病[1]。单核细胞聚集是动脉粥样硬化的一个重要环节，其黏附于血管内膜向主动脉内皮细胞下间隙迁移，分化为巨噬细胞，进而形成泡沫细胞[2]。近年来研究显示，单核细胞聚集由趋化因子调控，其中趋化素样因子超家族成员发挥重要作用[3]；
趋化素样因子超家族成员1(CKLFSF1)基因是该家族成员之一，目前关于其在冠心病发生中作用的研究仍十分少见。因此，本研究分析了CKLFSF1基因表达与冠心病发生风险的相关性，并使用人主动脉内皮细胞(HAECs)和人单核细胞THP-1在体外进行细胞学研究，探讨CKLFSF1基因参与冠心病发生与发展的相关机制。

1.1 研究对象

从2020年5月至2021年7月间在河南大学附属南阳市中心医院行冠状动脉造影检查的患者中选取右冠脉、左前降支、左回旋支及主要分支中1支及以上直径狭窄程度>50%的患者175例为冠心病组；
未达到上述诊断标准的非冠心病患者140例为对照组。排除标准：①合并恶性肿瘤，甲状腺、肝、肾、血液系统疾病的患者；
②合并感染性疾病、自身免疫学疾病的患者。入选患者均自愿参与本研究，签署知情同意书。

1.2 材料与主要试剂

HAECs购于上海弘顺生物有限公司；
THP-1购于上海中乔新舟生物有限公司。胎牛血清、DMEM培养基购于美国SIGMA公司；
细胞培养板、Transwells小室均购于南京讯贝生物有限公司；
Trizol试剂盒购于上海通蔚生物有限公司；
兔抗人血管细胞黏附因子(VCAM-1)单克隆抗体、兔抗人E-选择素蛋白单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体以及相应的二抗购于上海卓强生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1临床资料收集及实验室指标检测

收集患者的性别、年龄、体质量指数、吸烟史、合并糖尿病、合并高血压情况。空腹状态下采集患者空腹外周血5 ml，取其中3 ml室温条件下3 000 r/min离心15 min，分离血清和血浆，分装后-80℃保持待测。酶联免疫吸附法检测血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及血浆CKLFSF1蛋白表达水平。取另外的2 ml外周血，采用Trizol法提取总RNA，逆转录得到cDNA，行定量PCR反应，反应条件：95℃ 20 s，60℃ 45 s，95℃ 30 s，60℃ 20 s。取 RT-PCR产物5 μl，行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测CKLFSF1 mRNA表达水平。

1.3.2HAECs培养及转染

HAECs使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃ 5%CO2的细胞培养箱中培养。转染使用的过表达CKLFSF1腺病毒和低表达CKLFSF1腺病毒均由北京诺赛基因组研究有限公司包被。将HAECs按密度1×105个/孔的密度接种至6孔板中，培养至细胞融合度约80%时转染目的质粒，24 h后荧光显微镜下观察转染效率，高于90%。实验分为3组：正常HAECs组(常规培养，不做质粒转染处理)；
过表达CKLFSF1 HAECs组(转染过表达CKLFSF1腺病毒质粒)；
低表达CKLFSF1 HAECs组(转染低表达CKLFSF1腺病毒质粒)。

1.3.3THP-1培养

THP-1按1×105个/孔的密度接种于细胞培养瓶中，其中加有含10%胎牛血清的DMEM培养液，放入37°C 5%CO2的细胞培养箱中培养3 d，将细胞培养液转至15 ml离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃去上清，吹打混匀细胞悬液，按1∶3比例进行传代培养。

1.3.4细胞迁移实验

将3组HAECs分别计数5×104个接种于Transwells下室，加入DMEM培养液至600 μl，培养至HAECs完全贴壁后进行后续实验。将THP-1计数5×104个接种于Transwells上室，加入DMEM培养液至200 μl，培养12 h后取出上室，10%多聚甲醛溶液固定30 min，行姬姆萨染色，光学显微镜下进行细胞计数。

1.3.5细胞黏附实验

将3组HAECs分别按2×105个/孔接种于6孔板中，培养12 h后弃去培养液备用。将适量THP-1加入到15 ml离心管中，1 000 r/min离心10 min，加入3 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，以及浓度为10 mmol/L的钙黄绿素，室温下避光静置30 min，洗涤后进行细胞计数，按2×105个/孔将THP-1均匀铺至已备好的含HAECs 6孔板中，室温下避光静置2 h，弃去培养液，洗涤后加入少量DMEM培养液，在荧光显微镜下进行细胞计数。

1.3.6Western blot检测各组HAECs中VCAM-1和E-选择素蛋白表达水平

分别提取3组HAECs总蛋白，蛋白定量后电泳分离目标蛋白，湿法转膜后封闭，滴加兔抗人血管细胞黏附因子(VCAM-1)单克隆抗体(1∶500稀释)、兔抗人E-选择素蛋白单克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4℃过夜，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，1:2 000稀释，室温反应2 h，E-Gel Imager凝胶成像系统扫描并分析各条带灰度值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 25.0进行分析，计量资料以表示，采用方差分析和t检验，计数资料进行χ2检验，影响因素进行多因素Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组人口学特征和临床指标比较

冠心病组患者年龄、吸烟史比例、糖尿病比例、高血压比例以及总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；
男性比例、体质量指数在两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组人口学特征和临床指标比较

2.2 两组CKLFSF1 mRNA和血浆蛋白表达水平比较

冠心病组患者CKLFSF1 mRNA和血浆蛋白表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 两组CKLFSF1 mRNA和血浆蛋白表达水平比较

2.3 冠心病发生风险的多因素Logistic回归分析

见表3。以是否发生冠心病为因变量，年龄、吸烟史、糖尿病、高血压以及总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平为自变量，进行多因素Logistic回归分析显示，年龄、吸烟史、糖尿病、高血压、CKLFSF1是冠心病发生的独立影响因素。

表3 冠心病发生风险的多因素Logistic回归分析

2.4 细胞迁移实验结果分析

Transwells细胞迁移实验结果显示，过表达CKLFSF1 HAECs组中THP-1细胞迁移数量明显高于正常HAECs组，低表达CKLFSF1 HAECs组中THP-1细胞迁移数量明显低于正常HAECs组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图1，表4。

图1 CKLFSF1基因表达变化对THP-1细胞迁移能力的影响(×100)

表4 各组THP-1细胞迁移数量比较个，n=12)

2.5 细胞黏附实验结果分析

过表达CKLFSF1 HAECs组中THP-1细胞黏附数量明显高于正常HAECs组，低表达CKLFSF1 HAECs组中THP-1细胞黏附数量明显低于正常HAECs组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2，表5。

图2 CKLFSF1基因表达变化对THP-1细胞黏附能力的影响(×400)

表5 各组THP-1细胞黏附数量比较个，n=12)

2.6 各组HAECs中VCAM-1、E-选择素蛋白表达水平比较

过表达CKLFSF1 HAECs组中VCAM-1、E-选择素蛋白表达水平明显高于正常HAECs组，低表达CKLFSF1 HAECs组中VCAM-1、E-选择素蛋白表达水平明显低于正常HAECs组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图3，表6。

图3 各组HAECs中VCAM-1、E-选择素蛋白表达的Western blot电泳图

表6 各组HAECs中VCAM-1、E-选择素蛋白表达量比较

动脉壁慢性炎症反应所致的动脉粥样硬化是冠心病的病理基础，早期特征包括血管内皮损伤、单核细胞聚集至血管壁、血小板黏附[4]。研究者发现，冠心病的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果[5]；
随着分子生物学技术的快速发展，从基因层面上阐述冠心病的发病机制已成为目前研究热点之一。CKLFSF最早发现与肿瘤研究领域，作为抑癌基因参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程[6]。随着研究的深入，发现CKLFSF5基因rs723840位点多态性与冠心病相关[7]；
CKLFSF5基因与冠心病患者PCI术后血小板高反应性和心血管不良事件发生风险明显相关[8]。CKLFSF1基因属于CKLFSF，但目前关于CKLFSF1基因表达与冠心病发生风险的关系及可能机制仍鲜有研究报道。为此，本研究探讨了CKLFSF1基因表达与冠心病发生风险的相关性及相关机制。

本研究结果显示，年龄、吸烟史、糖尿病、高血压、CKLFSF1是冠心病发生的独立影响因素。随着年龄的增加，身体机能出现退行性变化，冠心病发生风险提升，与中青年冠心病患者相比，老年患者由于合并症较多，恶心、呕吐、咳嗽等冠心病的临床症状容易被隐匿，易错失最佳治疗时机[9]。烟草中含有焦油、一氧化碳、尼古丁等多种有害成分，会刺激并损伤血管，引发冠心病。高血糖对人体多个器官的正常生理功能均存在不利影响，特别是对心脏、肾脏、脑的影响最大，糖尿病患者长期高血压状态会促进动脉粥样硬化形成，导致冠心病[10]。相关研究显示，高血压患者中冠心病的发生风险是血压正常人群的4倍[11]。CKLFSF1基因mRNA和血浆蛋白表达水平是冠心病发生的独立影响因素，提示CKLFSF1基因表达与冠心病发生风险密切相关。

进一步分析CKLFSF1基因表达影响冠心病发生风险的相关机制，结果显示，冠心病患者CKLFSF1 mRNA和血浆蛋白表达水平明显高于对照组，且CKLFSF1基因过表达能够促进THP-1细胞向HAECs迁移、黏附，可推测CKLFSF1基因过表达能够促进动脉粥样硬化的发生与发展。对CKLFSF1基因促进THP-1细胞向HAECs迁移、黏附能力的相关机制研究显示，过表达CKLFSF1 HAECs组VCAM-1、E-选择素蛋白表达水平明显高于正常HAECs组；
低表达CKLFSF1 HAECs组VCAM-1、E-选择素蛋白表达水平明显低于正常HAECs组。VCAM-1主要表达于血管内皮细胞，配体与VLA-4相互作用能够促进白细胞透过血管壁至炎症部位，以及与T细胞、B细胞的相互作用[12]。E-选择素存在于内皮细胞，细胞活化后能够合成并分布于细胞表面，分布于内皮细胞、白细胞、血小板表面的E-选择素通过介导白细胞透过血管进入炎症区域组织以及另细胞再循环过程，参与凝血、动脉粥样硬化斑块形成、多发性硬化等多种生理病理活动[13]。本研究结果提示，CKLFSF1基因高表达能够通过上调VCAM-1、E-选择素表达来促进人单核细胞迁移和黏附，诱导人主动脉内皮细胞增殖，加速动脉粥样硬化及冠心病的发生与发展。本研究为CKLFSF1基因与冠心病发生风险的相关性又增加了一项新的研究证据。