纤维增殖灶是什么意思【自制中药提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响】

　　[摘要]目的:探讨自制中药提取物对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)增殖的影响。方法:在体外培养的人KFB、正常皮肤成纤维细胞(NFB)培养液中加入不同浓度的自制中药水提物、醇提物,采用倒置显微镜、CCK-8试剂盒及生化分析仪对成纤维细胞的形态、增殖活性、生长状况及乳酸脱氢酶(LDH)活性进行观察与测定。结果:在一定浓度中药提取物的作用下,KFB形态发生改变,增殖活性降低,LDH活性增高;其中醇提物抑制KFB增殖较水提物更有效,KFB对中药的抑制反应比NFB更敏感。结论:自制中药可能通过抑制KFB增殖、细胞毒性作用等而发挥治疗瘢痕疙瘩的作用。
　　[关键词]瘢痕疙瘩;中医药;成纤维细胞
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)05-0701-03
　　
　　Effects of extractant from self-made traditional Chinese drug on proliferation of keloid-derived fibroblasts
　　ZHAO Qing-li,MENG Ru-song,YANG Qing-qi,CAI Rui-kang
　　(Department of Dermatology,Air Force General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100036,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo study the effects of the extractant from the self-made traditional Chinese drug on the proliferation of keloid-derived fibroblasts (KFB).MethodsKFB and normal fibroblasts (NFB) were cultured in vitro. The aqueous or alcohol extractant in various concentr ation from the self-made traditional Chinese drug was added to the culture media. Inverted microscope, CCK-8 and biochemistry analysator were applied to observe or detect fibroblasts appearance, proliferation, growth and lactate dehydrogenase (LDH) activity.ResultsWithin certain concentration, after the extractant from drug taking action, KFB appearance was altered, the proliferative activity was decreased, the LDH activity was increased. In addition, the alcohol extractant inhibited the proliferation of KFB more efficiently than the aqueous extractant,KFB were more sensitive to drug than NFB. Conclusions The self-made traditional Chinese drug may produce a therapeutic effect by inhibiting the proliferation of KFB,cytotoxicity,etc.
　　Key words:keloid, traditional Chinese drug, fibroblast
　　
　　我们将全蝎等六味中药配制成软膏外用瘢痕疙瘩皮损处,经采用随机、对照试验方法进行临床观察,获得比较满意的结果(待发表)。本研究检测自制中药提取物对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响,旨在为瘢痕疙瘩临床治疗提供实验依据。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 实验材料:自制中药由全蝎、蚤休、丹参、生乳香、浙贝母、生甘草组成,其水提物、醇提物由中国中医科学院广安门医院制剂中心陈贤春药师制备。体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid Fibroblasts, KFB)6株、人正常皮肤成纤维细胞(Normal Fibroblasts, NFB)3株由中国医学科学院整形外科医院王春梅教授赠送。主要试剂及仪器包括CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)、倒置显微镜(日本OLYMPUS)、酶标阅读仪(450型 美国BIO-RAD)、全自动生化分析仪(日本 日立)。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 药物的配制:称取适量的自制中药水提物细粉加PBS溶解,高压灭菌;量取适量的醇提物液水浴蒸干,加二甲基亚砜及PBS溶解,微孔滤膜滤过除菌。水提物、醇提物均用细胞培养液(含DMEM、新鲜小牛血清、青霉素、链霉素)倍比稀释为31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、6 000μg/ml。
　　1.2.2 成纤维细胞形态学观察及增殖活性的测定:人KFB、NFB传代3～7代,加0.25%胰蛋白酶消化,制成5×104/ml细胞悬液,以100μl/孔(5×103细胞/孔)加入96孔板,培养箱中孵育48h。吸除原培养液,中药组KFB、NFB孔中分别加入31.25～16000μg/ml间10个浓度的中药水提物、醇提物培养液100μl/孔,阴性对照组KFB、NFB孔中加入培养液100μl/孔,每组均设3个复孔,培养箱中继续孵育48h。倒置显微镜下观察细胞形态并摄像。向各培养孔中加入CCK-8溶液10μl,培养箱中作用1h,在酶标仪上测定450nm处光密度值(OD值)。抑制率(%)=阴性对照OD值-中药组OD值/阴性对照OD值。
　　1.2.3 成纤维细胞生长状况的测定:根据增殖实验结果,设定抑制率为50%左右的自制中药醇提物浓度为本实验浓度。细胞接种同前。中药组KFB、NFB孔中加入2000μg/ml中药醇提物培养液100μl/孔,阴性对照组KFB、NFB孔中加入培养液100μl/孔,每组均设3个复孔,于培养箱中孵育24h、48h、72h、96h、120h时取出培养板,在相应孔中加入CCK-8溶液10μl,培养箱中作用1h,在酶标仪上测定450nm处OD值,将在各时间点测得的OD值绘制出生长曲线。
　　1.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定:KFB、NFB以2ml/孔(3×105细胞/孔)接种于6孔板中,方法同前。中药组KFB孔中分别加入31.25～16 000μg/ml间6个浓度的中药醇提物培养液2ml/孔,NFB孔中加入500μg/ml中药醇提物培养液2ml/孔,培养箱中继续孵育48h。收集上清,用全自动生化分析仪测定LDH活性。
　　1.3 统计学分析:将所有资料输入数据库,采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理,检测指标用x±s、率表示,统计分析方法为t检验。P0.05)(表3)。
　　3讨论
　　以往的研究表明,瘢痕疙瘩的发生与成纤维细胞生物学功能异常有关,主要表现为成纤维细胞活性增高及耐受性增强;KFB在离体时可继续产生高水平的胶原蛋白、纤维粘连蛋白、弹力蛋白、蛋白多糖等细胞外基质,在低浓度血清生长因子培养液中仍能持续生长[1]。藉此,检测药物作用后体外培养的KFB增殖性能,已成为多数学者探讨瘢痕疙瘩治疗药物作用机制的基本手段[2]。近年来,关于中药对KFB生物性状的影响已引起国内学者的重视,但所测定的中药多为单味药提取物或活性成分,关于复合中药的实验室研究为数有限[3-4]。
　　成纤维细胞是贴壁生长细胞,其形态并不固定,当培养条件发生改变、自身生理功能出现变化时容易在形态方面表现出来[5]。Aggeler等[6]认为,凡是能导致成纤维细胞变圆的试剂或条件,都能增加其胶原酶的合成。我们在倒置显微镜下观察到,当自制中药水提物、醇提物在浓度31.25～8000μg/ml范围内,KFB、NFB均有不同程度的细胞形态改变,这说明药物影响着成纤维细胞的正常生理功能,可能包括增加胶原酶的合成。
　　本研究的成纤维细胞增殖活性的测定结果显示,自制中药醇提物对KFB增殖的抑制浓度偏低,对KFB、NFB增殖的抑制呈浓度依赖性,而水提物的抑制浓度偏高,在较低浓度时其抑制作用明显降低,甚至有促进增殖作用。因此,我们认为自制中药醇提物对成纤维细胞增殖的抑制作用较水提物更有效,这可能与醇提法能更多地提取中药的有效成分有关,故在后续实验中我们仅采用醇提物进行检测。将成纤维细胞增殖活性测定与生长状况测定结果结合起来分析,我们发现KFB在中药醇提物、水提物作用下其增殖均被抑制,且药物浓度偏低,而NFB增殖的药物抑制浓度偏高,且对31.25～62.5μg/ml水提物的刺激呈现出增殖增强反应;在2 000μg/ml中药醇提物作用120h时,KFB增殖显现出持续地被明显抑制状态,而NFB增殖虽亦被抑制,但细胞增殖仍显现出逐渐增加的趋势。因此,我们认为自制中药具有较强的针对性,对KFB增殖的抑制作用更明显,即KFB对自制中药抑制的反应比NFB更敏感。
　　本研究还发现,当自制中药醇提物≥2000μg/ml浓度时,KFB培养液中LDH活性显著增加,这表明存在有细胞膜受损、LDH外释的现象,这提示我们本药物有可能是通过杀伤、破坏KFB而发挥作用的[7],同时也提醒我们盲目地增加本药物的浓度并不安全。
　　
　　[参考文献]
　　[1]陈海蓉,吴延芳.瘢痕疙瘩成纤维细胞研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志,2004,20(5):465-466.
　　[2]陈洪,农晓琳.皮肤病理性瘢痕的基础理论研究与进展[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(42):8358-8361.
　　[3]蒋文波,金兵,戴昭秋,等.中药对瘢痕疙瘩成纤维细胞抑制作用的研究进展[J].中医药学导,2006,34(5):55-56.
　　[4]林序文,吴浩俊,张培华.中药有效成分治疗病理性瘢痕研究进展[J].现代中西医结合杂志,2007,16(26):3920-3922.
　　[5]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].北京:世界图书出版社公司,2001:6-85.
　　[6]Aggeler J, Frisch SM, Werb I. Changes in cell shape correlate whit collagenase gene expression in rabbit synovial fibroblasts[J]. J Cell Biol,1984,98(5):1662-1671.
　　[7]陈明春,黄茂芳.积雪草甙和苦参碱对皮肤瘢痕成纤维细胞生长及胶原合成影响的研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2006,5(1):11-14.
　　
　　[收稿日期]2010-02-22 [修回日期]2010-04-10
　　编辑/张惠娟
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