[人表皮黑素细胞与ＨａＣａＴ细胞共培养体外模型的建立] 表皮黑素细胞的特征性结构

　　[摘要]目的：建立人表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养的体外模型，观察α-促黑素以及烟酰胺对黑素在两细胞间传递的影响。方法：分别培养人表皮黑素细胞和HaCaT细胞，接种黑素细胞48h后再将HaCaT细胞以1∶2的比例与黑素细胞共培养，分别以不同浓度的α-促黑素和烟酰胺干预共培养的细胞9天，Fontana-Masson 银染法观察共培养模型中黑素颗粒在两细胞间传递的情况。结果：培养3天即可观察到约20%HaCaT细胞核周围出现从邻近黑素细胞传递来的黑素颗粒，随着时间的延长阳性染色HaCaT细胞比例逐渐增多，第7天达到高峰（约80%），α-促黑素以及烟酰胺分别以浓度依赖方式促进/抑制了黑素颗粒在两细胞间的传递。结论：成功建立了人表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养体外模型，为大规模筛选促/抑黑素传递的药物奠定了实验基础。
　　[关键词]黑素细胞；共培养；HaCaT细胞；黑素传递
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2009）02-0188-03
　　
　　Establishment of the co-culture model of human melanocyte and HaCaT cell in vitro
　　MA Hui-jun, TIAN Yan, LIU Wen, LI You, ZHAO Guang,YANG Qing-qi
　　(Department of Dermatology, The Airforce General Hospital of PLA, Beijing 100142,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo establish an in vitro model of melanocyte and HaCaT cell co-culture model, and measured the melanin transfer effects induced by α-MSH and niacinamide using the model.MethodsHuman epidermal melanocyte was co-culture with HaCaT cell as 1∶2 ratio after 48 h of melanocyte first seeding on the dishes. Then melanin transfer was observed with Fontana-Masson method byα-MSH and niacinamide after 1,3,5,7,9 day of co-culture separately . ResultsAbout 20% HaCaT cells that have positive melanin stain around nuclear were observed after 3 day"s co-culture. With the time developed, the ratio of positive melanin stained HaCaT cell is increasing and reached its peak (80%) at the 7th day. In our model, the dose-dependent inhibitory and facilitative effects were observed respectively in niacinamide and α-MSH treated group.ConclusionsThe in vitro model of epidermal melanocyte and HaCaT cell co-culture system was successfully established and it offers a new, suitable, reliable and easy tool for the clinical evaluation of melanin transfer modulators.
　　Key words：melanocyte; co-culture; HaCaT cell; melanosome transfer
　　
　　表皮中的黑素细胞和角质形成细胞相互作用共同组成了表皮黑素单元，起着重要的调节皮肤颜色、防止紫外线辐射的作用。目前研究表明，人皮肤颜色主要受色素沉着过程的影响，除黑素细胞生成黑素外，黑素小体从黑素细胞向周围角质形成细胞的广泛传递过程在皮肤颜色调节中起着更为重要的作用[1]。目前黑素传递的研究多采用鼠系的瘤细胞或正常人表皮黑素细胞和角质形成细胞共培养来完成，但这两种共培养方法均有各自的局限性，限制了该方法在药物筛选中的广泛应用[2]。HaCaT细胞是成人皮肤中分离的一种永生化的角质形成细胞株，具有正常角质形成细胞所应有的特性，常用来替代人表皮角质形成细胞进行实验研究[3]。笔者通过不断的摸索和比较，将人表皮黑素细胞和HaCaT细胞进行了共同培养，并观察了α-促黑素（α-MSH）、烟酰胺对该共培养模型黑素传递的影响，为大规模筛选促/抑黑素传递的药物提供了实验基础。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 标本：正常人表皮黑素细胞来源于空军总医院泌尿外科门诊行包皮环切术的青少年（10～19岁，平均14.4岁）包皮；HaCaT细胞购自上海沪尚生物科技有限公司。
　　1.1.2试剂和仪器：DMEM培养基、MCDB153培养基、胰蛋白酶、角质形成细胞无血清培养基（keratinocyte serum free medium, KSFM）均为美国Gibco公司产品，进口胎牛血清（FCS）购自海克隆生物化学制品有限公司，左旋谷氨酰胺、分离酶（dispase）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)， 神经生长因子-β (NGF-β)，内皮素 1(ET-1)，霍乱毒素（CT），α-MSH、烟酰胺(Vpp)购自美国Sigma公司；分析纯硝酸银（常州市武进庙桥第二化工有限公司），纯氨水（天津市化学试剂一厂），25cm培养瓶、6孔培养板（美国Corning公司）。CKX31-A12PHP倒置显微镜、BX51TF显微镜（Olympus公司），Forma-3111 CO2孵箱（鑫态国际贸易有限公司）
　　1.2 方法
　　1.2.1 原代黑素细胞的纯化和培养：取包皮，碘伏消毒10 min，PBS洗涤3次，去除皮下组织，将包皮剪成1cm×1cm的小片，0.25%分离酶4℃放置12～16h，眼科镊轻轻分离表真皮，用0.25%的胰酶37℃消化表皮5～10min，吹打成细胞悬液，200目筛网过滤，PBS洗涤2次，参照以前的方法[4]稍加改良，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素， 50nM CT，5ng/ml bFGF，10ng/ml NGF-β，20μg/ml ET-1的MCDB153培养基稀释细胞，以4×105/ml的细胞密度接种到25cm的培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中常规培养。14～18天后待细胞长至80%融合状态时传代，0.05%胰酶消化细胞5min，见黑素细胞收缩浮起，即可用含血清的培养基中和胰酶，离心收集细胞悬液，传代培养，取2～4代的表皮黑素细胞用于实验。
　　
　　1.2.2 HaCaT细胞培养：HaCaT细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱静置培养，每3～4天传代1次。
　　1.2.3表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养：将已纯化的表皮黑素细胞消化离心后以2×104/ml的细胞密度贴壁培养于已消毒的盖玻片上，添加黑素细胞培养基继续培养48h后，将HaCaT细胞消化离心调整细胞密度为4×104/ml，接种于已有黑素细胞生长的盖玻片上，更换培养基为KSFM(添加牛垂体浸出物，表皮生长因子等），2天 换液1次，倒置显微镜下观察共培养细胞生长及形态学变化。
　　1.2.4 色素调节剂干预：根据文献[5]，分别选择α-MSH( 10，50，100nM)以及烟酰胺(0.1，0.5，1mg/ml) 于共培养当天添加入角质形成细胞无血清培养基中，药物连续干预3天，中间换含有药液的培养基1次，未添加药物的培养基作为空白对照，观察黑素细胞形态，检测黑素传递。
　　1.2.5 Fontana-masson 染色[6]：分别取经药物干预或无药物干预（空白对照）1，3，5，7，9天后黏附有共培养细胞的盖玻片，浸入PBS中5min，4%多聚甲醛固定20min，蒸馏水冲洗3次，入5%硝酸银-氨水溶液中56℃避光孵育1h，蒸馏水冲洗，1%氯化金溶液10min加强着色，蒸馏水冲洗，入5%硫代硫酸钠溶液还原3min，0.1%伊红复染1min，水溶性封片剂封片，显微镜下观察并摄片，计数在400倍光镜下随意15个视野中阳性染色的HaCaT细胞总数。黑素传递量以处理组阳性HaCaT细胞数/空白对照组阳性HaCaT细胞数×100%表示，每一实验重复4次。
　　1.2.6 统计学分析：统计过程使用SPSS10.0统计软件完成，采用t检验，数据均以x±s表示。
　　
　　2结果
　　2.1表皮黑素细胞与HaCaT细胞在倒置显微镜下的形态：表皮黑素细胞在本实验选用的培养基中多呈树突状生长，每个细胞有2～4个突起，细胞增殖较快约18天传1代；HaCaT细胞多呈鹅卵石样或菱形生长，具有紧密黏附生长的特性，HaCaT细胞增殖快，约4天传1代。
　　2.2 表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养在倒置显微镜下的形态：黑素细胞与HaCaT细胞共培养第1天始HaCaT逐渐增多，第9天达到融合状态，而黑素细胞的数量未有增加，相反随着培养时间的延长，黑素细胞数量有所减少，细胞间发生的接触增多，黑素细胞胞体也变成多角状，树突逐渐延长、突起增多，常有3～6个树突与周围多个HaCaT细胞发生接触（图1）。
　　2.2 Fontana-Masson 染色显示黑素颗粒：共培养第1天，HaCaT细胞内未见明显的黑素颗粒（图2a），第3天可见20%的HaCaT细胞核周出现明显黑素颗粒(图2b)，第7天约80%的HaCaT细胞核周出现明显黑素颗粒(图2c)，继续培养则未见含有黑素颗粒的HaCaT细胞比例明显增加。
　　2.3 α-促黑素、烟酰胺对黑素传递的影响：共培养3天后，α-促黑素以浓度依赖方式促进了黑素细胞内黑素向HaCaT细胞内的传递， 10、50、100 nMα-MSH分别使黑素传递量增加为130%、150%和165%；烟酰胺则以浓度依赖方式抑制了两细胞间黑素的传递，0.1、0.5、1mg/ml烟酰胺分别使黑素传递量递减为90%、83%、67%（图3）。
　　
　　3讨论
　　黑素在黑素细胞体内合成后以黑素小体的形式传递到周围的角质形成细胞并在角质形成细胞内重新分布和降解，从而起到调节皮肤颜色、抑制紫外线辐射的作用，此过程被称为黑素传递。黑素传递过程通过调节角质形成细胞中传递的黑素小体的大小、数量和分布从而影响着人的皮肤颜色[1]。目前，大多数的美白产品主要是是通过抑制黑素细胞内的黑素合成来发挥作用的，仅发现极少数美白剂如烟酰胺等具有抑制黑素小体向角质形成细胞内传递的作用。由于有关黑素传递的研究起步较晚，其确切的机制还远未被人们所认识。
　　以表皮中黑素细胞与角质形成细胞或各自对应的鼠瘤细胞进行共培养建立体外细胞模型是目前研究黑素传递的主要方法，但上述方法均存在一定的缺陷（如鼠源性的瘤细胞与人表皮细胞尚存在较大差异；原代人角质形成细胞培养增殖慢、不易纯化、传代易死亡等缺点），严重影响了该方法在大规模筛选黑素传递调节药物中的应用[2]。因此需要建立一种简便、快捷、与人生理状态最为接近的细胞模型来替代既往的细胞模型。我们在以前成功纯化培养表皮黑素细胞的基础上，经过不断的摸索和实践，将原代培养的人表皮黑素细胞与HaCaT细胞进行混合培养，并应用较为简便的Fontana-Masson银染法对共培养后的细胞是否发生了黑素传递进行了初步验证，发现共培养细胞在KSFM培养基中生长状态良好，随着时间的延长黑素细胞的比例逐渐减少而HaCaT细胞的比例逐渐增加，两细胞间的联系逐渐增多。与单独培养的黑素细胞相比，共培养的黑素细胞胞体变成多角状，树突逐渐延长、突起增多，常有3～6个突起与周围HaCaT细胞发生接触。提示共培养体系中HaCaT细胞可通过细胞接触发挥对黑素细胞的调控作用，这与体内情况相一致[7]。我们还发现共培养3天后约20%的HaCaT细胞核周发现由黑素细胞传递来的黑素颗粒。共培养7天后黑素传递量达到饱和状态（约80%），继续培养则未见含有黑素颗粒的HaCaT细胞比例再增加。说明黑素细胞与HaCaT细胞间的黑素传递在细胞接触后即可发生，当两细胞间的接触达到完全状态后，黑素传递也相应达到饱和。为了进一步验证该模型的敏感性，我们利用既往已经证实的两种黑素传递调节剂增殖α-MSH和烟酰胺对该模型进行了测试，发现共培养3天后，α-MSH以浓度依赖方式促进了黑素细胞内黑素向HaCaT细胞内的传递，烟酰胺则以浓度依赖方式抑制了两细胞间黑素的传递，与以往的研究结果基本一致[5]，从而说明该共培养模型可很好的模拟人生理状态下表皮黑素传递过程，从而替代原代表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系，与后者相比本模型具有细胞来源充分、研究周期短、易于重复的优点。
　　值得一提的是，实验中我们选择1∶2的黑素细胞与HaCaT接种比例主要是因为HaCaT细胞在KSFM中增殖明显快于黑素细胞，经3～4天共培养后两细胞间的比例达到1∶10，基本接近于生理状态。另外，本实验所采用的Fontana-Masson银染法由于其染色结果不易精细量化评价、敏感性也没有免疫荧光双标法强[2,6]，因此只能作为黑素传递研究的粗筛试验。如果借助流式细胞仪则可进一步获得更为可靠、敏感、精细的评价方法，这将为今后更好的研究黑素传递的分子机制、大规模筛选调节黑素传递的新药打下良好的基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2008-11-06[修回日期]2009-01-08
　　编辑/张惠娟