非洲猪瘟疫苗研究进展

邓 昊，王 涛，赵建军*

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；
2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨）

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种急性、高度传染性和致死性疫病。世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health,OIE）规定ASF 为必须上报的动物疫病，被我国列为一类动物传染病[1]。1921 年，肯尼亚首次发现ASFV，其之后在非洲持续流行，最终影响多达35 个非洲国家。20 世纪50 年代末到80 年代初，ASFV 在欧洲、俄罗斯、加勒比海和南美洲相继出现[2]。2018 年8 月，ASFV 首次传入我国辽宁省沈阳市[3]。ASFV 是非洲猪瘟相关病毒科（Asfarviridae）的唯一成员，含有囊膜包裹的二十面体结构，是一种脱氧核糖核酸病毒，也是唯一已知的虫媒DNA 病毒[4]。病毒粒子具有5 层结构，从外向内依次为囊膜、衣壳、内膜、核心壳和基因组[5]，基因组全长170~194 kb，编码150~200 种病毒蛋白，包括68 种结构蛋白和100多种非结构蛋白[1]。

近一个世纪以来，尽管科研人员通过多种途径创制ASF 疫苗，但研究表明，灭活疫苗不能提供免疫保护，亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗只能提供部分的免疫保护。而减毒活疫苗（Live-attenuated vaccines, LAVs）中的基因缺失疫苗是目前最有效的方案，越南通过该途径，在近日宣布成为世界首位发布ASF 商品化疫苗（ ASFV-G-∆I177L 为 疫 苗 株） 的 国 家（https://en.vietnamplus.vn），说明基因缺失疫苗有望成为“黑暗里的曙光”。

灭活疫苗主要通过物理（紫外线、高温、低温、高压等）、化学（苯酚、福尔马林、乙烯亚胺、焦碳酸二乙酯等）或两者相结合的方式使病原体失活。由于其生产工艺简单且安全，被广泛应用于疾病防控[6]。Cadenas-Fernández E 等[7]将灭活的ASFV 与新型佐剂（MF59®、Silica oil、mGNE、MontanideTMISA201）进行配伍，对猪采用皮内和肌肉同时注射高剂量（6×109HAD50）的灭活疫苗，接种后猪群健康状况正常。不幸的是，经强毒攻毒后，均出现与ASF 相似的临床症状，并发现存在疫苗接种猪临床反应滞后，因此，关于灭活疫苗抗体依赖性增强效应（ADE）的推测[8]，还有待进一步验证。ASF 灭活疫苗不能提供保护性免疫，这可能与灭活疫苗诱导的免疫应答有关。同时，也可能与ASFV 不同的感染性颗粒有关。

2.1 自然弱毒疫苗株

筛选自然弱毒株是创制疫苗过程中常用的方法，其广泛应用于动物传染病的预防。Gallardo C 等[9]在2017 年从野猪体内分离得到non-HAD特性的自然弱毒株（Lv17/WB/Rie1），免疫后，部分猪呈现亚临床症状，低病毒血症等。之后免疫猪与病毒感染猪同群饲养。结果发现，疫苗接种猪无一例死亡。自然弱毒疫苗在诱发免疫保护的同时，也会使部分猪出现非特异性的反应，包括瘀点、坏死灶、关节肿胀和肺炎等[10]。因此，解决自然弱毒疫苗的残余毒力，是未来急需解决的问题。

2.2 细胞传代培养弱毒疫苗株

上个世纪60 年代至90 年代，ASF 在西班牙和葡萄牙流行期间，研究人员成功分离ASFV 野毒株，经细胞传代培养后，其致病性减弱[10]。最近，研究学者将ASFV-G-∆I177L 疫苗株[11]经细胞传代后，获得其衍生毒株（ASFV-G-∆I177L/∆LVR）。动物感染实验表明，ASFV-G-∆I177L/∆LVR 和ASFV-G-∆I177L 一样对猪只无致病性，并具有免疫原性和保护作用[12]。虽然细胞传代致弱ASFV 是一种可行的方法，同时早期ASFV 弱毒株的研制主要通过细胞传代，如 BA71v，E75CV1 等，但增加传代次数会导致ASFV 免疫原性降低，难以提供对亲本毒株的攻毒保护，因而很难找到准确的传代次数进行后续动物试验，具有一定的盲目性和随机性[13]。因此，就目前而言，采用细胞传代技术创制ASF 弱毒疫苗不是最理想的方式。

2.3 基因缺失弱毒疫苗株

相比于自然筛选和细胞传代技术，目前最前沿和最主要的方法是采用反向遗传操作，将亲本强毒株毒力相关基因敲除，制备弱毒疫苗株（表1）。最新基因缺失活疫苗研究发现，对基因Ⅱ型同源强毒株（HLJ/18、ASFV-G、SY18）的攻毒保护能达到100 %[11,14-17]，而对基因Ⅰ型同源弱毒株（BA71∆CD2）和强毒株（Congo-a）却无法提供保护作用[18-19]。我国学者合成的HLJ/18-7GD（缺失7 个毒力相关基因）疫苗株对商品猪，妊娠母猪都能提供较强的保护作用，疫苗持续周期长，能保障商品猪顺利出栏，且不会造成母猪流产以及影响仔猪的生长发育[17]，是目前最有潜力的ASF 疫苗。Borca M V 等[11]利用反向遗传操作技术，敲除ASFV（ASFV-G 株）I177L 基因，从而构建的ASFV-G-∆I177L 弱毒株对亲代ASFV 攻毒具有良好的保护作用。经抗体检测发现，口鼻接种或肌肉接种产生的由IgG1、IgG2和IgM 介导的特异性抗体反应并没有差异。然而ASFV-G-∆I177L 和HLJ/18-7GD 并未涉及异源强毒株的攻毒实验，因此，上述疫苗株是否具有交叉保护作用还需要进行临床实验评估。Koltsova G 等[19]将Congo-a（一种适应细胞培养的衍生毒株）缺失 CD2v（EP402R）基因所构建的∆CongoCD2v 弱毒株，对猪群进行疫苗接种实验。结果显示，所有猪群经Congo-v 强毒株攻毒后，无一幸存。相反，用Congo-a 免疫猪群后，以同样的方法进行攻毒实验，猪群存活率为100 %。研究人员推断CD2v 是一种能诱发机体对同源毒株产生免疫保护的重要抗原[19]。基于以上研究表明，疫苗的交叉保护性和病毒关键毒力基因的鉴定是决定着基因缺失活疫苗发展的关键因素，值得深入研究。

表1 基于亲本ASF 毒株基因缺失活疫苗的最新研究进展

3.1 亚单位疫苗和活载体疫苗

ASF 亚单位疫苗的研发主要集中于ASFV 保护性抗原或抗原表位[20]。Lopera-Madrid J 等[21]首次在HEK 细胞中表达p72、p54 和p12 蛋白，进行初次免疫和加强免疫。结果发现，猪血清中含有特异性的抗体。接着用改良痘病毒（MVA）表达的B646L，EP153R 和EP402R 蛋白进行初次免疫和加强免疫，以及用MVA 表达的蛋白进行初免，HEK 细胞表达的蛋白进行加强免疫，两种方法均在血清中检测到特异性的抗体，且混合免疫的猪产生了特异性的T 细胞。上述研究停留在免疫应答，缺乏ASFV 强毒株的攻毒实验。亚单位疫苗同灭活疫苗一样，具有很高的安全性，但缺少对ASFV 保护性抗原的认知，以及如何诱导机体产生免疫保护的机制尚未阐明，从而制约了ASF 亚单位疫苗的发展。

活载体疫苗是将目的基因克隆到病毒基因组中，从而实现对目的蛋白的表达。相应的表达载体有腺病毒和改良痘病毒（MVA）等。Goatley L C 等[22]将B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R 基因克隆到腺病毒载体上，并进行初次免疫，同样的基因亚克隆到MVA 载体作为加强免疫。首次免疫59d 后进行攻毒实验，结果表明，免疫猪群的存活率为100 %。为了探究那种抗原能够诱导猪产生有效的细胞免疫，研究人员利用ELIspot 从133 种ASFV 蛋白中筛选出18 种蛋白，分别将其基因克隆到腺病毒和MVA，并进行免疫实验。研究表明，表达上述蛋白的病毒载体并不能使猪免受ASFV 强毒株的攻击[23]。ASFV 保护性抗原的鉴定是活载体疫苗成功的关键之一。同时，深入探究病毒抗原之间的相互作用，有利于发现新的免疫策略。

3.2 DNA 疫苗

DNA 疫苗是将病原体的基因片段克隆到表达载体上，通过在机体内表达目的蛋白，从而达到免疫的效果。目前较多的研究表明，DNA 疫苗能够引起猪强烈的细胞介导的细胞毒性T 淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）应答[23-24]。近期，国外学者将ASFV 的M488R 和MGF505-7R 基因克隆到pCMV 载体上，并与泛素相融合，构建了新型质粒（pCMV-Ub-M448R、pCM V-Ub-MGF505-7R）。两种质粒混合初次免疫猪，用BA71∆CD2 弱毒疫苗进行加强免疫。在攻毒实验中，DNA 疫苗的初次免疫增强了BA71∆CD2作为加强疫苗的保护作用。随后研究人员通过ELIspot，证实M488R 和MGF505-7R 两种蛋白是具有保护作用的T 细胞表位[24]。说明T 细胞作为机体适应性免疫的成员，在抵抗ASFV 中充当着重要的角色。因此，还应进一步探究ASFV 诱导细胞免疫的机制。

ASF 在我国虽已得到有效控制，但其危害性仍然存在且不可忽略，研发安全有效的ASF 疫苗依旧是当下亟需解决的问题。现有部分疫苗已在临床实验中表现出良好的保护作用，如我国研制的 HLJ/18-7GD 疫苗，口鼻免疫的 ASFV-G-∆I177L 疫苗等，但基因缺失疫苗的交叉保护性还有待进一步验证。众多活载体疫苗、亚单位疫苗和DNA 疫苗项目并未进行病毒攻毒实验，即使在猪群体内产生了特异性的抗体或T 细胞，但其是否有效，还需要进一步临床实验验证。对于灭活疫苗，研究表明，无法提供有效保护。

未来，应加强病毒与宿主相互作用以及复制过程中相关基因的研究。同时，利用好生物信息技术，对ASFV 潜在的靶点进行筛选和评估，通过体外实验和构建动物模型来论证靶点的有效性。除此之外，还需积极探究ASFV 相关蛋白抑制宿主免疫应答的机制，深入挖掘体液免疫和细胞免疫在对抗ASFV 感染时所扮演的“角色”，探索新的疫苗类型（mRNA 疫苗）等。随着对ASFV 结构深入的解析，阐明与机体相互作用的方式，以及相关新产品新技术的支持等，期待能够使ASF 疫苗实现新的突破。