饲粮中添加芦丁对肉鸡回肠形态、免疫、抗氧化及屏障功能的影响

刘慧娟，王 超，周斌斌，张佳琦，王 恬，庄 苏

(南京农业大学动物科技学院，南京 210095)

肠道既是动物机体消化、吸收营养物质的主要场所，也是机体主要的分泌器官和免疫器官[1]。肠道作为免疫的第一道防线，在维持机体肠道内环境稳态的同时可有效抵抗病原微生物及抗原物质进入肠细胞，保护肠道功能[2-3]。应激状态下，肠道功能受损，部分细菌和毒素可穿过胃肠道进入宿主体内，降低肠黏膜上皮细胞的抵抗力，继而破坏机体免疫，影响动物健康与生长。在动物生产过程中，氧化应激引起动物肠道组织形态改变，破坏肠内微生态平衡，导致肠道功能障碍，同时也可导致肠屏障功能损伤，造成肠道组织继发性感染，影响肠道健康[4]。多项研究表明，黄酮类物质作为一种高效抗氧化剂，能够有效缓解由氧化应激引起的肠道损伤，保护肠道完整性，提高其抗氧化能力[5-6]。芦丁(rutin)又称芸香甙，主要来源于芸香叶的一种黄酮类化合物，广泛存在于多种药用植物和食物中，为淡黄色或淡绿色针状结晶或结晶性粉末[7]。它具有抗氧化、抗炎、增强免疫和清除自由基等多种生物学功能[8-9]。研究表明，芦丁因其本身具备独特的黄酮多酚结构，主要在小肠被吸收或与小肠内源性蛋白质结合，进而在肠道组织或通过入血转运至机体其他组织中发挥作用[10]。Itagaki等[11]报道，芦丁能够清除大鼠肠道组织多余的活性氧进而保护肠道健康。Hassan等[12]研究证明，饲粮中添加芦丁能促进肉鸡生长，提高肉鸡抗氧化功能。目前关于芦丁的功能研究多集中在体外细胞或小鼠上，而对肉鸡肠道功能的研究较为缺乏，因此，本试验拟通过在肉鸡饲粮中添加不同水平的芦丁，从回肠组织形态、抗氧化、免疫和肠屏障功能方面系统评估芦丁的作用效果，以期为芦丁在动物生产中的应用提供理论依据。

1.1 试验动物及设计

1.1.1 试验设计 动物饲养及屠宰测定均经南京农业大学动物保护和使用委员会批准。试验择取1日龄AA肉鸡256只，随机分为4组，每组8个重复，每个重复8只，分别饲喂基础饲粮中添加0、250、500和1 000 mg·kg-1的芦丁。整个试验期为42 d，分为饲养前期(1～21 d)和饲养后期(22～42 d)。基础日粮(粉料)参照美国国家研究委员会NRC(2012)推荐营养水平配制，其组成及营养成分见表1。试验所用芦丁(纯度95%)购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；
试验肉鸡购自当地商品孵化场(南京，江苏)。

表1 基础饲粮组成及营养水平

1.1.2 饲养管理 试验期内，将所有肉仔鸡饲养在1个温度可控的房间内，每个重复(8只)饲养于1栏内，前4 d房间温度保持在33～34 ℃，之后逐渐降低为22 ℃直到试验结束。试验过程中，肉仔鸡自由采食和饮水。期间按鸡场饲养管理要求进行环境清理和常规免疫，保持舍内环境卫生并观察和记录肉鸡的精神状态和健康状况。

1.2 样品采集

在21日龄和42日龄时，试验鸡禁食12 h后，从各组每重复中随机选取1只鸡进行解剖，分离出肉鸡的回肠组织并取约2.0 cm的肠段组织于4%多聚甲醛溶液中固定，以备后续制备肠道切片。另取部分回肠样本，沿肠道纵轴用剪刀剪开肠腔，用载玻片刮取肠道黏膜于冻存管中，置于液氮冷冻后存于-80 ℃低温冰柜储存待测。

1.3 指标测定与方法

1.3.1 肠道组织形态观察 将回肠组织于4%多聚甲醛中固定48 h后，通过酒精、二甲苯处理，石蜡包埋、切片，并用伊红和苏木精染色后置于显微镜(ECLIPSE 80i型，尼康日本)下观察组织形态，用Image-Pro Plus软件测量绒毛高度(VH)，绒毛宽度(VW)和隐窝深度(CD)，并计算绒毛高度/隐窝深度比值(V/C)。

1.3.2 肠道黏膜免疫球蛋白测定 取21日龄和42日龄肉鸡肠道黏膜样品与0.9%的氯化钠溶液按质量/体积比(1∶9)匀浆后离心(4 ℃，3 000 r·min-1，15 min)，收集上清液按照ELISA法测定回肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量，试剂盒购自南京奥青生物有限公司。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定总蛋白(TP)含量计算回肠黏膜中每毫克蛋白含有的sIgA含量，测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 肠道抗氧化指标测定 取“1.3.2”中上清液测定丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性，所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测定步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 目的基因mRNA相对表达量测定 取回肠黏膜样品，使用TRIzol试剂(TaKaRa，大连)提取总RNA，通过qRT-PCR检测目的基因mRNA表达，以β-actin作为内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算各基因mRNA的相对表达量，具体操作根据先前研究方法进行[13]。引物序列见表2。

(续表1 Continued)

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 统计与分析

试验数据经Excel 2019初步整理后，采用SPSS 22.0分析软件对试验数据进行单因素方差统计分析，并用Duncan’s法进行多重比较，采用多项式中的线性和二次分析对芦丁不同梯度的效果进行分析。P<0.05表示差异显著，0.05≤P<0.10表示趋势性影响。

2.1 不同水平芦丁对肉鸡肠道形态组织结构的影响

由表3可知，饲粮中添加芦丁线性增加42 d回肠绒毛高度(PL<0.05；
PQ=0.090)，对21 d回肠V/C值有二次升高趋势(PQ=0.069)。与对照组相比，饲粮中添加250 mg·kg-1提高了21 d回肠V/C值，而添加500 mg·kg-1芦丁增加了42 d回肠VH(P<0.05)。添加芦丁对肉鸡前、后期VW和CD无显著影响(P>0.05)。

表3 不同水平芦丁对肉鸡回肠组织形态的影响

2.2 不同水平芦丁对肉鸡回肠黏膜sIgA含量的影响

如表4所示，饲粮中添加芦丁线性和二次曲线提高21 d回肠黏膜中sIgA含量(PL<0.05；
PQ<0.05)，且芦丁处理组回肠黏膜中sIgA含量显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中添加芦丁对42 d回肠黏膜中sIgA含量无显著影响(P>0.05)。

表4 不同水平芦丁对肉鸡回肠黏膜中sIgA含量的影响

2.3 不同水平芦丁对肉鸡肠道抗氧化指标的影响

如表5和图1所示，21 d时，饲粮中添加芦丁线性和二次曲线提高了回肠黏膜中T-AOC(PL<0.05；
PQ<0.05)以及HO-1 mRNA的表达量(PL<0.05；
PQ<0.05)，提高了GSH-Px活性(PL=0.096；
PQ<0.05)，线性增加NQO1 mRNA的表达量(PL<0.05)，并二次曲线降低回肠黏膜中MDA含量(PQ<0.05)，提高Nrf2 mRNA的表达量(PQ<0.05)；
与对照组相比，芦丁处理组显著提高回肠黏膜中HO-1 mRNA的表达量(P<0.05)，250和500 mg·kg-1芦丁组显著降低回肠黏膜中MDA含量(P<0.05)，提高GSH-Px活性(P<0.05)，同时添加250 mg·kg-1芦丁显著提高回肠黏膜中Nrf2 mRNA的表达量(P<0.05)，500 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中T-AOC和NQO1 mRNA的表达量也显著高于对照组(P<0.05)。42 d时，饲粮中添加芦丁线性和二次曲线降低回肠黏膜中MDA含量(PL<0.05；
PQ<0.05)，Nrf2和HO-1 mRNA的表达量呈二次曲线增加(PQ<0.05)，同时有提高T-SOD(PL=0.058；
PQ=0.055)与GSH-Px活性(PQ=0.053)趋势；
与对照组相比，添加500 mg·kg-1芦丁显著降低了回肠黏膜中MDA含量(P<0.05)，提高T-SOD活性和Nrf2、HO-1 mRNA的表达量(P<0.05)，250 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中HO-1 mRNA的表达量也显著高于对照组(P<0.05)。添加芦丁对回肠黏膜CAT活性和GSH-Px、SODmRNA的表达量无显著影响(P>0.05)。

表5 不同水平芦丁对肉鸡回肠黏膜抗氧化指标的影响

图1 不同水平芦丁对21 d(A)和42 d(B)肉鸡肠道抗氧化相关基因mRNA相对表达量的影响

2.4 不同水平芦丁对肉鸡肠道黏膜增殖与凋亡基因相对表达量的影响

如图2所示，21 d时，饲粮中添加芦丁二次曲线提高回肠黏膜中Bcl-2 mRNA表达量(PQ<0.05)，且250 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中Bcl-2 mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05)。42 d时，饲粮中添加芦丁线性提高回肠黏膜中Bcl-2 mRNA表达量(PL<0.05)，且与对照组相比，添加500 mg·kg-1芦丁显著增加了回肠黏膜Bcl-2和ki67 mRNA表达量(P<0.05)，1 000 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中Bcl-2 mRNA表达量也显著高于对照组(P<0.05)。芦丁对回肠黏膜中Bax和Caspase-3 mRNA的表达量无显著影响(P>0.05)。

2.5 不同水平芦丁对肉鸡肠道黏膜紧密连接蛋白基因相对表达量的影响

如图3所示，21 d时，饲粮中添加芦丁二次曲线提高了回肠黏膜中ZO-1 mRNA表达量(PQ<0.05)，且250和500 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中ZO-1 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。

图3 不同水平芦丁对21 d(A)和42 d(B)肉鸡回肠黏膜紧密连接蛋白相关基因mRNA相对表达量的影响

42 d 时，饲粮中添加芦丁线性提高回肠黏膜中ZO-1和Mucin2 mRNA的表达量(PL<0.05)，且与对照组相比，添加500和1 000 mg·kg-1芦丁可显著提高回肠黏膜中Mucin2 mRNA表达量(P<0.05)，500 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中ZO-1 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。此外，饲粮中添加芦丁有增加21 d回肠黏膜中Mucin2 mRNA(PQ=0.077)和42 d黏膜中CLDN2 mRNA(PL=0.058)表达量的趋势。

2.6 不同水平芦丁对肉鸡回肠黏膜炎症基因相对表达量的影响

如图4所示，21 d时，饲粮中添加芦丁使回肠黏膜中NF-κBmRNA表达量呈二次曲线降低(PQ<0.05)，且250和500 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中NF-κBmRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。42 d时，饲粮中添加芦丁线性和二次曲线降低回肠黏膜中IL-2 mRNA的表达量(PL<0.05；
PQ<0.05)，NF-κBmRNA表达量呈二次曲线下降(PQ<0.05)，且与对照组相比，芦丁处理组可显著降低回肠黏膜中IL-2 mRNA的表达量(P<0.05)，500 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中NF-κBmRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。此外，饲粮中添加芦丁能够线性降低42 d回肠黏膜中TNF-αmRNA表达量(PL<0.05)，但对Myd88和IFN-γmRNA的表达量无显著影响(P>0.05)。

图4 不同水平芦丁对21 d(A)和42 d(B)肉鸡回肠黏膜炎症相关基因mRNA相对表达量的影响

3.1 不同水平芦丁对肉鸡肠道形态结构和肠屏障功能的影响

肠道是机体养分消化与吸收的主要场所，肠道形态结构指标，如肠道绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)及绒毛高度与隐窝深度比值(V/C)等，是衡量饲料转化效率的重要指标[14-15]。在本试验中，与对照组相比，饲粮中添加250和500 mg·kg-1芦丁分别提高了21 d回肠V/C值和42 d回肠VH，这与马绍航[16]发现的山银花黄芩提取物(一种黄酮类物质)能够显著提高肉鸡肠道VH和V/C值，增强肉鸡对营养物质消化吸收功能的结果相似。Kamboh和Zhu[17]研究表明，染料木素和橙皮苷可显著提高肉鸡肠道中VH和VW，改善肠道形态结构。张佳琦等[18]研究也发现，日粮添加芦丁能显著提高仔鼠空肠VH和VW，改善断奶仔鼠空肠绒毛形态。芦丁含有独特的黄酮多酚结构，它可以在小肠内被吸收或与小肠内源性蛋白质结合后对肠道组织发挥有益作用，防止肠道损伤[10, 19]，这可能是芦丁能够改善肉鸡肠道形态结构的主要原因之一。Bcl-2和ki67能够抑制细胞凋亡、参与细胞增殖调控，在组织器官生长发育过程中具有重要作用[20]。Bax是Bcl-2的同源基因，当Bax表达过量时自身可结合成同源二聚体，促进细胞凋亡[21]。ki67是细胞增殖的标志物。在本试验中，与对照组相比，添加250 和1 000 mg·kg-1芦丁分别提高了21和42 d回肠黏膜中Bcl-2 mRNA表达量，500 mg·kg-1芦丁组显著增加回肠黏膜中Bcl-2和ki67 mRNA的表达量，结合芦丁对肉鸡回肠V/C和VH的影响结果，提示饲粮中添加适宜剂量芦丁对促进肉鸡肠道绒毛生长和改善肠道结构具有积极作用。

肠上皮紧密连接结构(TJ)是构成肠道机械屏障结构的主要连接方式[22]，它是由大量功能性和结构性蛋白组成，包括OCLN、CLDN2和ZO-1等[23]。ZO-1是通过与其他蛋白质(CLDN和OCLN)的相互作用来保持肠道紧密连接的关键因素之一。OCLN和CLDN表达下降可直接破坏紧密连接结构的完整性，导致肠屏障功能障碍。在本试验中，添加250和500 mg·kg-1芦丁显著提高了21 d回肠黏膜中ZO-1 mRNA的表达量，500 mg·kg-1芦丁组42 d回肠黏膜中Mucin2和ZO-1 mRNA的表达量也显著高于对照组，这与Gil-Cardoso等[24]研究相似，其结果发现，添加榭皮素可促进肠道中ZO-1和OCLNmRNA的表达量，保护肠道屏障结构的完整。Noda等[25]也证明，黄酮类化合物对肠道屏障功能具有促进作用。因此推测，饲粮中添加芦丁可能通过增强肠道黏膜紧密连接蛋白的表达量来完善肉鸡肠道屏障结构，维护肠道功能。

3.2 不同水平芦丁对肉鸡肠道黏膜免疫功能的影响

肠道黏膜免疫是机体抵御病原微生物入侵的第一道防御屏障，sIgA是其主要效应因子[26]。sIgA主要分布于黏液层由肠道浆母细胞分泌，是肠道黏膜免疫的核心，能够保护肠上皮细胞免受损伤[27]。本试验结果显示，与对照组相比，饲粮中添加250、500和1 000 mg·kg-1芦丁显著提高21 d回肠黏膜中sIgA含量，而对42 d回肠黏膜中sIgA含量无显著影响，这可能是由于肉鸡前期的免疫系统暂未发育健全，添加芦丁后能够影响和促进肉鸡免疫系统的发育，而随着生长期的延长，肉鸡免疫系统逐步发育成熟与完善，芦丁对免疫系统的作用效果也逐渐减弱。

NF-κB介导的信号通路参与体内多种反应，它是一种转录因子，参与炎症过程中的调节[28-29]，当其过度表达时可诱导相关促炎因子的转录和合成[30]。TNF-α和IL-2是促炎性细胞因子，能够诱导机体的炎症反应，并受NF-κB转录水平的调控[31]。本试验结果显示，芦丁处理组回肠黏膜中IL-2 mRNA表达量显著低于对照组，且与对照组相比，饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁显著降低21和42 d回肠黏膜中NF-κBmRNA表达量，因此推测，肉鸡饲粮中添加芦丁能够通过抑制NF-κBmRNA的表达量，下调相关炎症因子的表达从而对机体发挥抗炎作用。该结果与Yeh等[32]和Su 等[33]研究结果相似，即芦丁能够显著抑制小鼠肺部或乳腺中NF-κBmRNA的表达，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等多种促炎症因子的水平，具有较强的抗炎作用。

3.3 不同水平芦丁对肉鸡肠道黏膜抗氧化的影响

抗氧化能力能够反映机体的健康状况，机体内的氧化系统和抗氧化系统共同参与调节自由基的生长与消除，抗氧化酶是一种存在于细胞环境中的蛋白质，它具有较强清除体内自由基的活性作用。T-SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化的关键酶，也是抗氧化系统中的重要组成部分[34]。T-SOD可维持机体氧化与抗氧化系统平衡。T-AOC表示机体总抗氧化能力， MDA含量直接决定机体脂质过氧化程度，是机体评价脂质氧化损伤的重要指标，同时也可间接反映肠黏膜细胞的损伤程度[35]。在本试验中，与对照组相比，添加250和500 mg·kg-1芦丁显著降低21 d回肠黏膜中MDA含量，500 mg·kg-1芦丁组42 d 回肠黏膜中MDA含量显著低于对照组，提示芦丁能够缓解肠道脂质氧化损伤。此外，500 mg·kg-1芦丁组21 d回肠黏膜中T-AOC和GSH-Px活性及42 d T-SOD活性均显著低于对照组。本试验结果与Hassan 等[12]研究结果相似，其发现饲粮中添加芦丁能够显著提高肉鸡血清中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量。张佳琦等[18]研究也显示，芦丁能够显著降低小鼠肠道中MDA含量，提高SOD活性。芦丁因其结构含有丰富的酚羟基，可以通过抽氢反应产生较稳定的苯氧自由基进而中止链式反应，同时活泼氢与机体内自由基结合，及时清除机体内过多的ROS，这可能与芦丁能够有效抑制肉鸡肠道脂质过氧化，并通过增强酶促和非酶促抗氧化系统来提高肉鸡的抗氧化能力的关键原因之一[11, 36]。

Nrf2在体内抗氧化信号通路中可通过调下游相关抗氧化基因表达如HO-1、NQO1等来提高机体的抗氧化防御系统[37]。HO-1作为一种抗氧化酶在应激状态下能够保持机体细胞稳定性，当其表达上调时有助于增强机体抗氧化功能，缓解组织氧化损伤[38]。本研究发现，与对照组相比，21 d时，芦丁处理组显著提高回肠黏膜中HO-1 mRNA的表达量，添加250 和500 mg·kg-1芦丁分别提高了回肠黏膜中Nrf2和NQO1 mRNA的表达量；
42 d时，500 mg·kg-1芦丁组回肠黏膜中Nrf2和HO-1 mRNA的表达量显著高于对照组，故推测饲粮中添加500 mg·kg-1芦丁可能通过增强Nrf2信号通路来调节肉鸡肠道的抗氧化功能，这与王斌等[39]研究发现灌胃芦丁(100 mg·kg-1)可通过Nrf2/HO-1信号通路缓解小鼠肾氧化应激损伤，提高其抗氧化功能的结果一致。同时，本试验结果也发现，与500 mg·kg-1芦丁组相比，1 000 mg·kg-1芦丁组42 d肉鸡回肠黏膜中Nrf2 mRNA的表达量显著下降，这与Féres等[40]研究发现，添加2 000 mg·kg-1芸香苷(芦丁含量为(76±3)%)可对机体产生一定副作用的结果相似，但其具体机制尚需要进一步研究。

饲粮中添加芦丁可改善肉鸡回肠形态结构、提高肠道免疫、屏障功能并通过增强回肠组织中Nrf2信号通路增强其抗氧化能力。在本试验条件下，综合芦丁对肉鸡全期的作用效果，推荐芦丁添加量为500 mg·kg-1。