成纤维细胞名词解释【病理性瘢痕成纤维细胞中连接蛋白４３的免疫电镜观察】

　　[摘要]目的：观察连接蛋白43（Connexin43,Cx43）在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达，探讨Cx43及其构成的缝隙连接在病理性瘢痕中的调控作用。方法：取正常皮肤2例、正常修复组织2例、增生性瘢痕5例、瘢痕疙瘩5例，用特异性抗体（Cx43）作为标记物,用胶体金标记的IgG作示踪物进行免疫电镜观察Cx43的分布与表达，并对其进行定位, 同时观察不同标本成纤维细胞的超微结构变化。结果：Cx43在正常修复组织及正常皮肤成纤维细胞的胞浆及近胞膜上表达，且明显集中于粗面内质网；Cx43在增生性瘢痕成纤维细胞的表达明显减少，粗面内质网中见到少许Cx43金颗粒的聚集；瘢痕疙瘩成纤维细胞仅在胞浆中见到少许Cx43散在金颗粒。结论：成纤维细胞Cx43的表达下调可能是造成病理性瘢痕组织中成纤维细胞间缝隙连接细胞间通讯异常，从而导致病理性瘢痕发生的因素之一。
　　[关键词]连接蛋白43；病理性瘢痕；免疫电镜
　　[中图分类号]R619+.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）01-0063-03
　　
　　Immunoelectron-microscopy observation of Cx43 in fibroblasts of pathological scar
　　ZHANGJuan-juan1,LV Shi-jun2
　　(1.Department ofStomatological Histopathology; 2. Department ofPathology, Weifang Medical Collage, Weifang 261042,Shandong,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the role of connexin43 and gap junctional intercellular communication composed of it in pathological scar by studying expression of connexin43 in fibroblasts.MethodsThe expression, distribution and orientation of Cx43 were observed in 5 hypertrophic scars,5 keloids,2 normal repaired tissues,2 normal skin samples by immunoelectron-microscopy with special antibody for marker and gold colloidal labelled IgG for tracer. The ultrastructure of fibroblasts were also observed.ResultsIn normal skin and repaired tissues, Cx43 were largely expressed at endochylema, cell membrane, and concentrated at the rough endoplasmic reticulum. It was clearly reduced in hypertrophic scars, a few Cx43 granules were observed at the rough endoplasmic reticulum. There were hardly Cx43 granules in keloids.ConclusionLower expression of Cx43 in the fibroblasts maybe one reason of leading to pathological scar. It has a correlation between Cx43 and the abnormality of gap junctional communication channel and Cx43 may have important function in the regulation of pathological scar.
　　Key words: connexin43; pathological scar; immunoelectron-microscopy
　　
　　增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)和瘢痕疙瘩(keloid, K)统称为病理性瘢痕，是皮肤对创伤、炎症、烧伤、外科或自发的一种过度的皮肤纤维增生性疾病，为当今医学研究的热点之一。病理性瘢痕的发病机制复杂，对其形成机理的研究主要集中在细胞因子的生物学作用以及成纤维细胞和肥大细胞等方面[1]。近年来研究发现病理性瘢痕的发生与缝隙连接介导的细胞间通讯异常有密切的关联。缝隙连接（Gap junction）散在分布于细胞间，是相邻细胞间的直接亲水性通道，为生物界普遍存在的细胞间信息交换方式[2]。连接蛋白43（Connexin43，Cx43）是真皮成纤维细胞表达最丰富的一种连接蛋白，它广泛存在于哺乳动物各器官、组织中，与机体许多病理生理过程有密切的联系。我们对不同瘢痕组织成纤维细胞中Cx43的表达情况进行了观察，探讨Cx43及其构成的缝隙连接在病理性瘢痕中的调控作用。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 标本来源及实验分组：本实验所用标本均取自潍坊市人民医院整形外科，包括瘢痕疙瘩（瘢痕疙瘩边缘部，即周边1/3半径范围内)5例、增生性瘢痕（增生性瘢痕边缘部，即周边1/3半径范围内）5例及正常修复组织（组织损伤后10天左右）2例，正常皮肤2例，所有病人均未经激光、冷冻、激素等治疗。病理性瘢痕结合临床及病理学检查诊断明确，取材部位为头面部、前胸、四肢等。
　　1.2主要试剂与仪器：兔抗人Cx43多克隆抗体 (Zymed Laboratories,USA),10nm胶体金标记羊抗兔IgG及山羊血清封闭液购自北京博奥森生物技术有限公司，电镜为日本H-7500型透射电镜。
　　1.3胶体金标记免疫电镜：①将标本切成1mm3大小，立即放入4%多聚甲醛中固定；②由潍坊医学院形态学教研室电镜室制作免疫电镜样品并进行超薄切片，厚度50～70nm，载于200～300目的镍网上；③1%H2O2 10min，以增进树脂的通透性，有利于抗体的进入。双蒸水洗10min×3次； ④将镍网覆于正常羊血清(1:20稀释)滴上，室温封闭30min，TBS(pH 7.4)洗3min×3次；⑤将镍网置于兔抗Cx43抗体(1:50稀释)液滴上4℃孵育过夜。以TBS代替一抗为阴性对照。复温30min，TBS(pH7.4)洗3min×3次，TBS(pH8.2)洗3min×3次；⑥将镍网覆于胶体金标记的羊抗兔IgG(1:20稀释)液滴上，室温2h，TBS(pH8.2)洗3min×3次，TBS(pH7.4)洗3min×3次；⑦1%戊二醛后固定15min，TBS(pH7.4)洗3min×3次，双蒸水喷洗2次；⑧5%醋酸铀(新鲜双蒸水配制)避光染色15min，双蒸水喷洗2次，枸橼酸铅染色5min，双蒸水喷洗2次，滤纸吸干网缘水分，透射电镜观察结果。
　　
　　2结果
　　
　　免疫电镜结果显示正常皮肤组织中成纤维细胞粗面内质网、线粒体、高尔基复合体等细胞器发育正常，粗面内质网上有丰富的Cx43阳性金颗粒聚集，在其基底层细胞胞浆内及细胞接触处亦可见Cx43阳性金颗粒(图1、2)；正常修复组织成纤维细胞呈梭形或不规则形，胞质内粗面内质网、游离和多聚核糖体丰富，高尔基复合体发达，胶原合成活跃。在其胞浆及近胞膜上大量Cx43金颗粒聚集，粗面内质网上聚集尤为明显，在两成纤维细胞的连接处亦可见到Cx43金颗粒的聚集(图3、4)；增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中可见到不同时期的成纤维细胞，有多个粗细不等、长短不一的突起。核为卵圆形，常有切迹。核内染色质分布均匀，在核膜下较密集，并可见到1-2个明显的核仁。多数细胞胞浆内可见大量扩张的粗面内质网，高尔基复合体也很发达，并可见到分泌小泡，胶原合成旺盛，细胞周围分布有胶原原纤维。Cx43金颗粒在增生性瘢痕成纤维细胞的表达明显减少，少许粗面内质网中见到Cx43金颗粒的聚集(图5、6)；瘢痕疙瘩成纤维细胞仅在胞浆中查见少许Cx43的散在金颗粒，细胞接触部位未查见金颗粒聚集(图7、8)。
　　
　　
　　3讨论
　　
　　成纤维细胞是瘢痕形成的效应细胞，在病理性瘢痕的形成过程中起主导作用。成纤维细胞为何在创伤已经修复后，仍处于增殖及生物合成失控状态，是因为成纤维细胞的广泛异质性，还是细胞因子的综合作用，或是成纤维细胞增殖与凋亡失衡导致，其原因尚有待研究。有研究通过粘附式细胞仪检测证实正常瘢痕成纤维细胞间通讯正常，增生性瘢痕成纤维细胞间通讯受到抑制，瘢痕疙瘩成纤维细胞间通讯被阻断[3]。另有研究发现，正常瘢痕成纤维细胞一旦相互接触后则停止增殖，而增生性瘢痕中部分成纤维细胞和瘢痕疙瘩中成纤维细胞接触后仍继续增殖[4-5]。这些研究结果表明病理性瘢痕的形成过程中成纤维细胞间缝隙连接的异常可能是导致其旺盛增殖的原因之一。当发生病理性瘢痕时，细胞间的缝隙连接通讯异常，是由于细胞内连接蛋白的表达异常，还是连接蛋白在组装成为缝隙连接的过程存在障碍，或是细胞间缝隙连接的开启与关闭障碍，这些都会引起细胞间缝隙连接细胞间通讯的异常，从而影响细胞间的信息交流，导致病理性瘢痕的发生。
　　缝隙连接是由相邻细胞间两侧质膜的连接子（Connexon）相连接形成的通道，连接子是由六个形状相同、功能一致的蛋白分子亚基，即连接蛋白（Connexin, Cx）围绕中央孔道排列形成的跨膜蛋白通道。连接蛋白通常根据分子量大小来命名，目前已克隆出19种鼠类和20种人类的连接蛋白基因[6]。Cx43是由总跨度为2768碱基对的三条互补脱氧核糖核酸所编码的，它编码分子量为43kDa的含有378氨基酸的多肽，是一种非突变型抑癌基因[7]。Cx43广泛存在于哺乳动物各器官、组织中，其分子结构和功能特点决定了它与机体许多病理生理过程有密切的联系。Cx43表达短暂降低可促进细胞的增殖，但随着伤口的不断愈合，细胞内表达产物会随之变化，Cx43的表达量逐渐增加，从而形成更多的缝隙连接细胞间通讯，有利于细胞间的信息交流，大量增殖的细胞会逐渐凋亡[8]。若Cx43的表达持续低水平甚至不表达，会导致缝隙连接的形成障碍，影响细胞间的信息传递，出现细胞的持续增殖，这一结论在细胞增殖旺盛的肿瘤组织中已得到了证实[9-10]，这也可能是病理性瘢痕组织中成纤维细胞持续旺盛增殖的一个原因。
　　我们的免疫电镜结果显示Cx43主要表达于成纤维细胞胞浆的粗面内质网及细胞的连接处，且在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达明显减少。这说明病理性瘢痕组织成纤维细胞中Cx43的表达下调，从而缝隙连接的形成减少，细胞间信息交流障碍，使得成纤维细胞在伤口愈合过程中相互接触后仍能旺盛增殖，分泌大量细胞外基质，胶原过度合成与沉积，这可能是病理性瘢痕形成过程中的重要机制之一。当然若同时存在Cx43组装成为缝隙连接的过程障碍，或者细胞间缝隙连接的开启与关闭及功能障碍，同样也会导致这一结果。对于这些因素，我们将在以后进行更深入的研究。能否通过修复病理性瘢痕组织中的缝隙连接来抑制病理性瘢痕中成纤维细胞的增殖，对病理性瘢痕的基因治疗具有重要意义，有待进一步研究。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2008-09-28[修回日期]2008-12-10
　　编辑/张惠娟