【一种脱细胞真皮基质制备方法的研究】 真皮由什么细胞和基质等构成

　　[摘要]目的：研究脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）的一种新的制备方法。方法：取大鼠背部皮肤制成厚度0.8mm的脱毛皮片，置入1mol/L NaCl溶液中24h，揭去表皮层，再浸入0.5%Triton X-100溶液中室温震荡48h，得到ADM。取标本行组织学观察，并行异体移植实验。结果：NaCl-Triton法制作的ADM，细胞成分脱除彻底，胶原纤维排列规则，没有明显的免疫原性，生物相容性好。结论：采用NaCl-Triton法制备ADM,价廉而有效，利于推广应用。
　　[关键词]脱细胞真皮基质，制备
　　[中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）08-1176-02
　　
　　Research to a preparation method of acellular dermal matrix
　　MAO Yu-long1,LV Ji-zhong2,SONG Bing1
　　(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Binzhou Medical Collage Affiliated Hospital, Binzhou 256603, Shandong, China; 2.Department of Stomatology, Heze Medical Collage)
　　
　　Abstract：ObjectiveTo research a new method of producing acellular dermal matrix (ADM). MethodsThe non-hair skin grafts with 0.8mm in thickness were acquired from the back of Wistar rats". Then the grafts were treated with 1M NaCl 4℃ for about 24 hours to rip away the cuticular layers, and the remained dermis were immerged into 0.5%Triton X-100 shaking in normal temperature for about 48 hours to obtain ADM. Took samples of the ADM to do histology observation, and homoplastic tronsplantation.ResultsThere was no cell constituent remained in ADM produced by NaCl-Triton method, and the collagen fibers were in a regular arrangement. ADM had very low immunocompetence and good biocompatibility.ConclusionUsing NaCl-Triton method to produce ADM was low-cost and effective, so it was advantageous to populize application.
　　Key words：acellular dermal matrix; preparation
　　
　　皮肤或粘膜缺损是口腔颌面外科常见病症。自体移植是最佳方式，但常面临皮源不足的制约，故研究真皮替代物具有重要意义。脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）源于天然皮肤，动物实验和初期临床应用已证明其为理想的真皮替代物[1-2]。ADM的制备方法不一，结合文献[3-4]，我们探讨了利用NaCl-Triton法制备ADM的可行性。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1实验动物：健康成年雌性Wistar大鼠46只（购于山东大学实验动物中心，合格证号SCXR(鲁)20030004），体重(250±25)g，随机分为供皮组（10只）和异体埋植组（36只）。
　　1.2 试剂与仪器：TritonX-100（美国amresco公司产品）；SCW-CJ-1B(1BU)型超净工作台（苏州宏瑞净化科技有限公司）；SGQ-250A鼓式自锁取皮机（上海医疗器械有限公司手术器械厂）；IMAGE-PROPLUS病理图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。
　　1.3 实验步骤
　　1.3.1取皮：大鼠脱臼处死，背部剪毛，脱毛膏脱毛。切取全厚皮片后用鼓式取皮机反取为厚0.8mm，大小2cm×2cm皮片，共40块，浸入0.1%新洁尔灭溶液脱脂30min。
　　1.3.2制备ADM：所有皮片置入1 mol/L NaCl溶液，4℃处理24h，揭去表皮层。再置于0.5%TritonX-100溶液中，常温震荡48h，开始每3～4h换液一次，至处理液不再变为混浊，改为每8h换液一次，制得ADM。取出ADM，PBS冲洗10min×7次，再将ADM浸于青霉素溶液抗菌处理30min。取出ADM将其放入灭菌生理盐水中，4℃冰箱储存。脱毛皮制备仅采用脱毛膏脱毛，不进行脱表皮和脱细胞处理。
　　1.4观测指标
　　1.4.1 物理性状：观察ADM的质地、颜色、弹性和韧性等。
　　1.4.2 组织学观察：标本经4%多聚甲醛固定后，分别进行HE染色和VG染色，光镜下观察。同时取正常大鼠背部皮肤标本，做组织学对比观察。
　　1.4.3 抗原性和生物相容性检测：大鼠36只，24只埋植ADM，12只埋植脱毛皮。3%水合氯醛1ml/100g作腹腔注射麻醉，麻醉生效后于大鼠硬腭部两侧做距上颌磨牙腭侧龈缘约0.1cm纵行切口，前端止于第一磨牙近中水平，后端止于第三磨牙远中水平，以骨膜剥离器将粘骨膜从骨面剥离，前后端均不断蒂。将ADM由一侧切口塞入粘骨膜下，使其基底膜面面向粘骨膜，平展于粘骨膜和骨面之间。同样方法埋植脱毛皮。分别于埋植后7天，14天，28天处死动物，切取标本，4%多聚甲醛固定，行HE染色，光镜下观察。
　　
　　2结果
　　
　　2.1大体观察：所得ADM质地柔软，在其表面可见较多毛囊开口，伸展性好，有较大的拉伸强度，弹性较差。
　　2.2组织学观察：真皮内各种细胞成分均已被脱除，血管及毛囊部位余留空隙，胶原纤维纤细，排列尚整齐，基底膜结构完好（见图1）。
　　
　　2.3抗原性和生物相容性：移植后7天，局部有少量炎性细胞浸润，并有成纤维细胞移入ADM；14天，成纤维细胞数量较多，大量新生毛细血管长入，细胞无坏死及异型性变，纤维无水肿及坏死，未见明显炎症细胞；28天，ADM与粘骨膜贴合紧密，细胞数目变少，未见胶原纤维异常。脱毛皮在7天有大量炎细胞浸润（中性粒细胞），组织水肿明显，周边有积液；14天，脱毛皮内仍有较多炎细胞，出现少量成纤维细胞，胶原支架疏松；28天，脱毛皮胶原纤维更加疏松，仍见到较多量的淋巴细胞，成纤维细胞分布范围增加。
　　
　　3讨论
　　
　　ADM的制备要点在于尽可能地去除细胞成分，同时尽量完整保留其内的基质支架。目前常采用的制备主要有DispaseⅡ-Triton法、高渗盐-SDS法、高渗盐-酶消化法和NaOH销蚀法等。上述方法都有一定的劣势：NaOH销蚀法胶原破坏较重；高渗盐-SDS法和高渗盐-酶消化法等虽基底膜保存较好，但Ⅳ型胶原纤维，纤维连接素含量较多，而且残留微弱的HLA-DR活性，因而有相对高的抗原性；DispaseⅡ、胰蛋白酶等价格相对较高，操作过程复杂，其制作的ADM成本过高，不适于批量生产[5]。
　　分析文献报道，我们首次联合使用高渗盐（NaCl）和 Triton制备ADM。高渗盐可作用于基底膜复合物，使锚着细丝与表皮基底细胞半桥粒离断，分开表皮层与真皮层，与DispaseⅡ相比能保留更完整的基底膜[3]。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成可溶性的复合物，溶解于溶液，进而使真皮细胞及其细胞器溶解，使细胞成分自纤维支架上脱除[6]，其脱细胞能力要强于SDS。二者联用可取得理想效果。我们实验观察到：使用高渗盐作用24h，可以完整揭除表皮层；再应用Triton常温振荡48h，经组织学检验可完成去除真皮中的细胞成分，保留较完整的纤维支架，得到ADM。硬腭粘膜下异体移植后观察发现：与脱毛皮引发明显的炎症反应相比，ADM不被机体排斥，并和周围腭部组织融合，这提示此法制得的ADM无明显免疫原性，生物相容性好。同时制备的试剂采用NaCl和Triton X-100组合。NaCl价格低廉，来源广泛，Triton X-100溶液仅使用极低浓度，这样极大地降低了制备成本，利于推广应用。
　　ADM作为一种新兴真皮替代物,因为其低抗原性、快速血管化和一定的稳定性，应用于临床修复口腔颌面皮肤和粘膜缺损取得可观的效果。我们采用NaCl-Triton法制备出合格的ADM，证明此法低廉而有效，适合批量生产。
　　
　　[参考文献]
　　[1]Tung CS, Zighelboim I, Scott B, et al. Human acellular dermal matrix for closure of a contaminated gynecologic wound[J]. Gynecol Oncol, 2006, 103(1):354-356.
　　[2]Adams JE, Steinmann SP.Interposition arthroplasty using an acellular dermal matrix scaffold[J]. Acta Orthop Belg, 2007, 73(3):319-326.
　　[3]Walter RJ, Matsuda T, Reyse HM, et a1.Characterization of acellular dermal matrices(ADMS) prepared by two different methods[J].Burns,1998,24(2):104-113.
　　[4]左金华,李金荣,李武修.一种脱细胞真皮基质制备方法的初探[J].口腔医学研究,2003,19(4):258-260.
　　[5]Mizuno H,Takeda A,Uchinuma E.Creation of an acellular dermal matrix from frozen skin[J]. Aesthetic Plast Surg, 1999, 23(5):316-322.
　　[6]宋金丹.医学细胞生物学[M].北京:人民卫生出版社,1995:62-63.
　　
　　[收稿日期]2008-05-14[修回日期]2008-08-13
　　编辑/张惠娟