肝脏缺血再灌注损伤【肝脏缺血再灌注损伤研究进展】

　　[摘要] 肝脏缺血再灌注是临床上常见的病理现象，近年的研究发现钙超载与氧化应激和多种炎症因子在再灌注损伤中起着重要作用，Kupffer细胞和一氧化氮分子同时具有保护和加重损伤双重作用。
　　[关键词]肝脏;缺血再灌注损伤； 机理
　　[中图分类号] R333.4[文献标识码] B[文章编号] 1005-0515（2011）-02-271-02
　　[Abstract] The hepatic ischemia-reperfusion injury is one common clinical pathologic event.Recent studies have indicated that calcium-overloading, oxidative stress and various inflammative cytokines play very important roles in the ischemia-reperfusion injury, while Kupffer cells and nitric oxide exhibit double-edge effects with protection or exacerbation in the ischemia-reperfusion injury process.
　　Keywords: Liver; Ischemia-reperfusion injury; Mechamism.
　　
　　肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是临床上常见的病理现象，在肝移植、肝脏肿瘤切除手术、大出血、休克等过程都伴随IRI的发生。虽然其机制尚未完全明确，但是对其许多环节的研究已经有了突破性的进展。
　　1 肝脏IRI的钙超载与氧化应激
　　在缺血状况下，细胞的内部会发生一系列变化，其中最显著的是由于缺氧而导致的细胞内部钙超载。在正常状态下，细胞质中的Ca2+的浓度远低于细胞外基质和内质网，维持这个离子梯度需要多种离子泵的作用，如钠钾ATP酶、钙ATP酶以及镁ATP酶。缺血缺氧的条件下细胞有氧呼吸受阻，仅依赖无氧酵解葡萄糖产生ATP并不足以维持这些离子泵的运转，细胞内外的离子浓度梯度便会遭到破坏。而且无氧呼吸产生的乳酸因为无法通过血液循环离开组织而堆积，造成细胞内外的酸化，也会降低甚至损伤离子泵的功能。离子泵功能下降导致细胞内Ca2+浓度升高，而这又会促进内质网储存的Ca2+的释放，同时细胞内Na离子浓度升高是Na/Ca交换体活性上升，进一步使细胞内Ca2+浓度上升[1]。Ca2+作为第二信使，它的浓度升高会引起细胞内部一系列变化，尤其是酶的激活，也正是这些酶的激活引起了许多细胞损伤。首先，Ca2+可以激活钙依赖蛋白酶催化黄嘌呤脱氢酶（XDH）转化为黄嘌呤氧化酶(XOD)，XOD在有氧的情况下可以催化次黄嘌呤分解并产生大量的自由基，是再灌注损伤中自由基的重要来源之一[2]；其次，Ca2+的内流还会使高电导性通道-通透性转换孔（permeability transition pore,PTP）开放，改变了线粒体膜的通透性，使线粒体内的钙释放入细胞质，进一步加重钙超载，也会造成线粒体嵴和外膜等膜结构的破坏[4]。线粒体的破坏会释放其中的cyt-C、AIF、Smac/DIABLO等蛋白，这些蛋白可以通过caspase途径引发细胞凋亡[3]。而且缺乏cyt-C的线粒体在有氧状况下电子传递受阻不但无法产生ATP，反而会生成大量自由基破坏细胞结构、诱发细胞凋亡和坏死[2]；最后，钙激活的磷脂酶、核酸内切酶也会损伤细胞，引发凋亡和坏死[5]。
　　再灌注时的氧化应激也是引发细胞损伤的重要原因，自由基的来源除了XOD和线粒体外，还由Kupffer细胞和中性粒细胞呼吸爆发产生。细胞和组织中原有的抗自由基分子如GSH和SOD等不足以应对大量的自由基，导致膜结构中的脂质、吡啶碱基和蛋白质遭到氧化，而且自由基会破坏细胞内抗中性粒细胞蛋白酶系统[6]，再加上钙超载等因素最终使细胞膜以及线粒体膜的通透性改变，引发细胞凋亡和坏死。而且自由基还会激活核转录因子NF-κB，使其从与Iκ-B的结合状态下被释放，而后进入细胞核调节转录，在Kupffer细胞中会引发其释放IL-6、TNF-α等细胞因子,在血窦内皮细胞中则会上调其表面ICAM-1、P-Selectin等粘附分子的表达，加重后续的炎症反应[7]。
　　2 肝脏IRI的分期
　　目前在缺血再灌注损伤的研究中，再灌注损伤主要分为两个阶段：第一个阶段是再灌注开始到6个小时以内的急性损伤。这个阶段肝脏实质细胞的凋亡和坏死主要由自由基和TNF-α介导。同时，Kupffer细胞分泌趋化因子，内皮细胞表面的粘附分子的表达会上调，其机理见前述；第二个阶段是从6小时之后24小时之内，这个阶段肝实质细胞的损伤主要由中性粒细胞造成的。这些中性粒细胞大多是被趋化因子募集而来，被内皮细胞表面的粘附分子捕获并渗透进入肝脏实质。在Kupffer细胞分泌的IL-1、IL-6以及TNF-α等细胞因子的作用下活化，产生剧烈的炎症反应，其呼吸爆发会产生的大量的自由基，同时会分泌蛋白酶和细胞因子，最终导致大量的肝实质细胞丧失功能或者死亡[8]。
　　3 肝脏IRI中的重要细胞
　　Kupffer细胞的作用也早有描述，在再灌注之前，由于内皮细胞的部分凋亡的刺激，作为肝组织中的单核吞噬细胞，Kupffer细胞就已经开始分泌促炎症的细胞因子了。而再灌注时，更多的内皮细胞凋亡、组织中自由基含量的升高以及补体的激活会活化Kupffer细胞，使其吞噬能力增强，并诱导其分泌TNF-α、IL-1、IL-6和CXC等，引发炎症反应[3]，因此多数人认为Kupffer细胞在IRI中扮演着负面的角色。但是近期的研究发现，在再灌注损伤中，完全的去除Kupffer细胞反而会加剧炎症和损伤，这说明Kupffer细胞也能起到保护作用。进一步的研究表明，是在肝脏中定居的Kupffer细胞而不是血液中游走的单核细胞起到了保护作用，它们通过分泌HO-1，来诱导巨噬细胞向自稳态方向分化，使巨噬细胞的促炎症作用被抑制[9]。而这类定居于肝脏的Kupffer细胞中只有Hmox+/-和Hmox+/+两种亚型才有分泌HO-1的功能，而Hmox-/-型Kupffer细胞并没有这种保护作用[10]。
　　T细胞在募集中性粒细胞的过程中起着重要的作用。在T细胞缺陷的动物体内，再灌注时中性粒细胞的募集明显受阻，而补充CD4+T细胞则会基本恢复中性粒细胞的募集，补充CD8+T细胞则没有这种效果，这说明CD4+而不是CD8+的T细胞在中性粒细胞的募集中起着重要的作用[11]。不过传统认识中CD4+T 的激活需要抗原的存在和APC细胞的抗原加工和提成，但是实验中并没有外来抗原的存在，而且CD4+T细胞在再灌注开始后的1小时内即被迅速被募集到该区域，这说明在再灌注损伤中CD4+T细胞是由于细胞因子的作用而发生了不依赖抗原的激活，或者是由于体内自身抗原受到自由基损伤后成为了抗原[12]。CD4+T细胞在被激活后会释放如TNF-β、IFN-γ和G-CSF等细胞因子，从而进一步放大Kupffer引发炎症和募集中性粒细胞的作用，但T细胞是否在激活Kupffer细胞起决定作用上尚不清楚[11]。
　　血窦内皮细胞(SEC)作为肝脏循环系统中的重要组成部分，在IRI中扮演着重要的角色。首先，它作为直接接触血液的细胞，所经历的氧浓度变化最为剧烈，发生凋亡早于肝实质细胞，甚至在再灌注之前就已经有少部分细胞发生凋亡。其损伤机制如前述主要是由于钙超载和自由基引起的一系列对于线粒体和细胞膜结构的损害，最终导致细胞凋亡；其次，SEC不但维持着正常的血管结构，还具有重要的分泌功能。组织中的NO有两个来源，第一个是由血窦内皮细胞NO合酶（eNOS）产生，这部分NO对于维持血管舒张有着重要作用的；第二个来源是诱导型NO合酶（iNOS），即各种细胞在一定条件下诱导而分泌的NO。再灌注开始时可检测到NO浓度降低、内皮素（ET）释放量增加。NO可以舒张血管而ET有很强的缩血管作用，但ET的分泌受到NO等物质的抑制。在再灌注的情况下，组织中的NO含量下降使ET所受到的限制减少，引起血管强烈收缩而导致微循环障碍，严重影响了肝脏细胞恢复其正常功能并诱发该区域坏死。再灌注时NO能够通过生成过硝酸盐中和自由基，降低自由基的浓度，进而减弱自由基活化NF-κB的作用。NO含量的增加就可以减少炎症因子的产生和中性粒细胞的粘附和渗透作用，这可能就是NO抗炎症的途径之一。另外，一些研究也发现NO可以促进cGMP的生成，cGMP浓度的上升可以舒张血管改善血液循环，而且cGMP还能减少中性粒细胞的募集，但这种抗炎症作用的机理目前并不清楚，因为IL-6的分泌并不因为cGMP含量的增加而减少[14]。iNOS mRNA的大量表达产生的NO与自由基反应虽然能够中和一部分自由基，但是在再灌注条件下，细胞普遍表达iNOS mRNA和大量的自由基反应会引发过硝酸盐的损伤[15]。另一方面，如果完全阻断NO的生成却会使再灌注损伤更加严重，这是因为阻断eNOS会失去它对抗血管收缩和炎症的作用[16]。
　　最后，正常时SEC表面ICAM-1的很少，但再灌注后，在NO、自由基和TNF-α等细胞因子的作用下ICAM-1等粘附分子表达明显上升，使其免疫粘附作用加强，对于后续的中性粒细胞的募集起了至关重要的作用[17]。
　　4 肝脏IRI的对策与前景
　　虽然IRI的机制很复杂，但是在临床上已经有了一些对策。目前最广泛使用的也是有效的就是缺血预处理（IPC），即在手术前先对会缺血的区域进行短时间的缺血和再灌注，由于时间较短所以不会引起太大损伤，但却可以明显的增强组织对于缺血的耐受力，因而对于较短时间的缺血（1-2小时之内）能起到很好的减轻损伤作用。IPC的机制十分复杂，也是目前的研究的热点。一些研究证实，腺苷A1受体（A1R）的阻断剂能极大的抵消IPC的作用，这说明，IPC可能是通过激活A1R等受体，降低细胞中腺苷的浓度，减少黄嘌呤氧化酶催化的底物，也就减少了自由基的生成[18]。另外也有发现证实IPC起到保护作用也可能是通过促进HO-1的分泌来达到的[10]。当然IPC的作用不止如此，在动物实验中观察到的Ca超载的减轻等现象不能完全通过这些途径来解释，但是这些研究给我们研究IPC的机制带来了新的思路。
　　另外，间断肝门阻断（intermittent portal triad clamping ,IC）也是一种有效的减轻IRI的手段，即术中每隔15-30分钟的缺血后进行5分钟的灌注，这可能是因为短时间的缺血并不会导致细胞发生大量死亡。在大于75分钟的手术中IC对肝脏的保护作用要强于IPC，尤其对于有肝硬化等病变的患者效果更为明显。但是，这种方法带来的失血也是一个不小的问题[19]。
　　如果能用药物控制钙超载、内皮细胞表达粘附分子、中性粒细胞的募集等某个环节，减轻再灌注损伤，就可以极大的降低手术的难度和病人的危险。但是这些环节中所隐藏的机理很多都没有被完全揭示，而且相关的分子在再灌注损伤中的作用往往是十分复杂的，如NO的双重作用，简单的使用药物增加或减少它们都不能得到满意的效果。所以仍然需要大量的研究来揭示其中的联系，从多个方面入手，综合解决再灌注损伤的问题。
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