睾丸皮肤局部变白【睾丸支持细胞介导局部免疫耐受的进展】

　　机体的某些特殊部位在植入异体组织后不会发生排斥反应，且这些移植组织可长期存活，如眼、睾丸、脑等特殊区域，这些区域称为免疫豁免区[1]。免疫豁免区的组织若移植到其他部位，能抵抗排斥反应而存活，诱导局部产生免疫耐受。睾丸是天然的免疫豁免区，研究证实睾丸支持细胞（Sertoli cells，SC）是维持其免疫豁免功能的主要细胞[1]，共同移植SC可延长同、异体移植物的存活时间，因而，SC的免疫豁免特性倍受关注。现就SC共
　　移植在同、异体移植方面的进展综述如下。
　　
　　1SC的免疫豁免功能
　　
　　SC在体外可诱导异种淋巴细胞凋亡，而学者通过将从2～4周大SD大鼠收集来的SC与Balb/c小鼠淋巴细胞共培养，用流式检测细胞凋亡，FasL、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和丛生蛋白用免疫细胞化学检测，结果发现免疫细胞化学显示SC表达FasL、TGF-β1，并可诱导小鼠淋巴细胞凋亡的实验，提示SC表达的FasL及TGF-β1与异种移植的免疫豁免有关[2]。
　　1.1 SC高表达FasL:Fas(又称APO-1，CD95)是一个细胞表面分子，属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）受体家族，是由325个氨基酸组成的I型膜蛋白， Fas的胞内区有一个约由70个氨基酸组成的保守区域，为凋亡信号转导所必需，称为死亡结构域，Fas在许多组织中表达，尤其是小鼠的胸腺、肝脏、心脏、肺、肾、卵巢等。Fas配体（Fas ligand，FasL）由281个氨基酸组成，为Ⅱ型膜蛋白，属于TNF家族。与TNF一样，FasL也可被膜上的金属蛋白酶加工成可溶性FasL。FasL主要表达活化的T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）。目前已通过免疫组织化学、逆转录酶PCR （reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）、原位杂交、Northern Blot等多种方法证明睾丸中支持细胞高表达FasL。
　　1.2 SC分泌免疫抑制因子:SC长期以来被认为在睾丸中具有调节免疫应答的作用，但以前的研究认为SC高表达FasL是其免疫豁免特性的来源，FasL/Fas系统是参与T细胞介导的移植物排斥的关键调控系统，移植物通过FasL有效地诱导前来攻击的淋巴细胞或粒细胞凋亡而保护自身，获得免疫豁免。但目前也有学者认为SC分泌的免疫调节因子，特别是TGF-β，在免疫豁免中具有重要作用[3]。TGF-β具有抑制B细胞分化为浆细胞；抑制NK细胞功能；抑制白细胞介素-2（inter leukin-2， IL-2）的产生和下调T 细胞上的IL-2受体等复杂的免疫调节能力。研究发现SC具有良好的分泌功能，可分泌多达100多种蛋白质，分泌的大量免疫抑制因子抑制T、B的活性及IL-2的产生[4]。除TGF-β外，其分泌的其他主要免疫调节因子的种类和作用如下： 白介素-1 (inter leukin-1 ，IL-1) ：IL-1包括两种由不同基因编码产生的分子量均为17kD左右的多肽分子， IL-1β主要是分泌型，人体内IL-1活性主要由IL-1β介导。它主要通过自分泌或旁分泌刺激其他的细胞因子和炎症介质产生（如IL-6, IL-B, TNF-β等）；诱导抗原提呈细胞表面免疫分子的表达，为T淋巴细胞的活化提供第二信号；促进B淋巴细胞的增殖、分化；介导免疫球蛋白的分泌，由此激活补体，杀伤细胞及吞噬细胞的活性，增强细胞免疫和体液免疫而介导组织损伤过程。胰岛素样因子II(insulin-like growth factor ，IGF-II) 抑制淋巴细胞增殖。抑制素(Inhibin) 刺激胸腺细胞分裂。活化素(Activin) 抑制胸腺细胞分裂。转铁蛋白(Transferrin) 替代血清使有丝分裂原刺激的T细胞在体外生长，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH) 诱导外周淋巴细胞产生LH样因子，层粘连蛋白(Laminin) 增加巨噬细胞的吞噬能力等。
　　
　　2表达FasL基因在异体移植中的应用
　　
　　组织正常表达的FasL能诱导免疫豁免的现象，促使人们探索利用基因工程技术人为诱导组织表达FasL来保护移植物的存活。
　　2.1在肝脏移植中：Li等将表达FasL的载体质粒（pFasL）以不同的剂量（90、180、270、360mg）经HVJ病毒转染到小鼠肝细胞中，术后3、5、7、14天检测FasL表达水平，结果发现只有转染了适量pFasL（10%）转染组小鼠存活，明显提高同种异体移植物的存活时间，移植物中可见浸润的活化T细胞凋亡。如转染剂量高于180mg，则可直接导致转染小鼠发生致死性肝炎而死亡，而转染剂量较低时小鼠虽能存活，但并不能延长移植物的存活时间[5]。可见正常组织表达FasL的剂量是研究的关键问题。
　　2.2在肾脏移植中：Swenson应用腺病毒将FasL转移至大鼠肾脏，能延缓同种异体移植物的排斥反应。实验表明，FasL在肾的表达能持续二周，移植后肾的存活从正常的12天延长到28天，在另一系统中，移植物存活长达56天[6-7]。由此可见，因移植方法、剂量等的不同，具有明显不同的效果。
　　2.3在肺组织移植中：将FasL基因转移到移植的肺组织并结合环孢菌素A处理，与对照组相比，移植5天后，气体传输大为好转，急性的排斥也由于FasL的表达而大为减轻[8]。FasL的表达与免疫抑制剂具有协同保护移植物的作用。
　　2.4在血管组织移植中：由腺病毒将FasL基因导入血管内皮细胞，一星期后减少了T细胞和巨噬细胞的浸润，2个月后降低了血管的病变[9]。
　　2.5在甲状腺组织中：转染FasL基因至甲状腺滤泡细胞，随后移植甲状腺到基因型不同的小鼠，结果移植物完全不受排斥。发现这与FasL的表达水平有关，表达水平越高，移植耐受越好[10]。
　　2.6在胰岛移植中：在1996年Lau等[11]将转FasL基因导入的肌纤维瘤细胞（1×106）与纯化的C57BL/6小鼠胰岛细胞共移植，结果显示移植物发挥功能长达100天，而移植0.5×106个FasL阳性肌纤维瘤细胞，仅能轻度延长移植物存活时间。失败的主要原因是肌纤维瘤细胞失去了长期表达FasL的能力。但也有研究发现经腺病毒转染FasL的胰岛细胞可表达FasL，并介导Fas阳性细胞的凋亡，但同时也导致胰岛细胞功能障碍。而将可溶性FasL利用基因枪修饰的胰岛细胞异体移植后则效果良好。故认为腺病毒转染可能不是胰岛细胞基因修饰的最佳方法。
　　2.7在心脏移植中：T细胞与树突状细胞相互作用可引发免疫排斥或免疫耐受，而起决定因素作用的为树突状细胞表面分子的表达及周围的微环境中细胞因子的水平。因此，树突状细胞的基因修饰可调控免疫应答。实验发现转染FasL的树突状细胞明显增强诱导Fas阳性细胞凋亡的能力，在体外实验中可抑制同基因的MLR，在体内实验中可引发FasL阳性的树突状细胞与Fas阳性T细胞相互作用，导致T细胞凋亡，介导异型抗原的低反应性，可以明显延长MHC不匹配的异体心脏移植物的存活时间。认为转染FasL的树突状细胞可诱导对异型抗原的无应答或低应答反应，阻止器官移植的排斥。因此，认为在肝、肾、肺、血管、甲状腺、心脏、胰岛移植过程中，FasL的引入性表达保护了同种异体移植物免受排斥。
　　
　　3支持细胞共移植的研究进展
　　
　　FasL是维持免疫豁免组织和免疫豁免部位的关键性因素。1995年，Bellgrau等[1]将从C57BL/6小鼠睾丸收集的SC移植入BALB/c小鼠肾包膜下（非免疫豁免部位）也可引发免疫豁免，反之，来源于突变型的gld C57BL/6（SC不表达有功能的FasL）小鼠的SC则被排斥，表明SC可诱导移植后的免疫豁免部位的产生。从此对SC在共移植方面的作用成为研究热点。后来通过关于胰岛细胞和SC共移植与转染FasL的胰岛细胞移植的比较，发现共移植组可产生明显的免疫豁免，而转染FasL的胰岛细胞反而导致粒细胞浸润，胰岛细胞凋亡，加速了移植物功能的减退。因此，目前认为移植SC比转FasL基因更具有优越性：①SC天然表达FasL，无需复杂操作，表达不稳定的转基因程序；②天然的SC能持久、稳定地表达FasL；③移植SC不会引发内分泌紊乱；④SC可来源于同种异体的男性器官捐献者的睾丸供体；⑤移植安全，不违背法律、医学伦理。目前已有关于SC与神经元细胞、胰岛细胞、肝细胞、肾细胞及甲状旁腺细胞共移植的研究，现分述如下：
　　3.1 SC对共移植神经元细胞的保护作用：SC与神经元共移植的研究开始较早，目前已部分应用于临床。脑组织本身为免疫豁免部位，SC与异体、异种神经元共移植于大脑纹状体，移植物体积增大，神经元细胞存活数量明显增多，胞体增大，细胞突起增多，同时少突胶质细胞浸润减少。表明SC在脑组织中，可保持其免疫支持的作用，并分泌大量蛋白质及细胞因子，对多巴受类神经元的存活及增殖具有促进作用。但也有实验发现神经元细胞与SC混合后，同样共移植于异种大脑纹状体后，移植物中心有激活的少突胶质细胞，同时移植物体积明显缩小，在术后1周可见SC，但术后2周则SC少见。类似的实验，出现不同的结果，可能与SC的功能状态及SC与神经元细胞的比例不同有关。
　　3.2 SC对共移植的胰岛细胞的保护作用：胰岛移植是治疗I型糖尿病的有效方法，接受异种和同种异体移植物的主要障碍是T细胞介导的宿主反应。因此，SC与胰岛共移植是目前研究热点。有研究表明将Wistar大鼠的胰岛细胞及SC移植入糖尿病模型的SD大鼠肾包膜下，观察移植物存活情况，并体外检测睾丸SC对活化淋巴细胞的抑制作用以及移植物内淋巴细胞凋亡情况。结果发现单纯移植胰岛组平均存活期为6天，睾丸SC和胰岛细胞共移植，当睾丸SC数量为5×106时，移植的胰岛平均存活期为10天，而移植睾丸SC数量增加至1×107时，移植胰岛存活期大于50天。同时发现在体外SC浓度在1×106～1×107/ml时对活化的淋巴细胞抑制作用最明显，再增加剂量，抑制作用不再明显增加，表明SC对淋巴细胞的抑制作用具有剂量依赖性。而在体内FasL局部表达诱导浸润的活化淋巴细胞凋亡，使邻近的胰岛细胞获得免疫豁免，从而免受宿主淋巴细胞攻击，延长移植物的存活[12-13]。
　　3.3 SC对共移植的甲状旁腺细胞的保护作用:甲状旁腺功能低下可导致低血钙的发生。2004年国内学者将Wistar大鼠的甲状旁腺细胞与SC共移植于SD大鼠肾包膜下，观察移植物存活情况和血钙及PTH测定，发现单独移植甲状旁腺细胞组存活期为17.22天，而共移植SC后，存活期明显延长，可长达48.8天，且FasL的表达及凋亡指数随着移植的SC数量（1×106～4×106）增加而增加，认为SC的FasL表达诱导了浸润的活化淋巴细胞凋亡，使共同移植的甲状旁腺细胞存活期延长。SC的FasL表达保护了甲状旁腺细胞，但其必须达到一定数量后才能做到稳定持续的表达，从而充分发挥其免疫豁免的特性[14]。
　　3.4 SC对共移植的肾脏细胞的保护作用：肾功能衰竭直接影响生存质量。有学者将Wistar大鼠的SC及肾脏细胞移植入SD大鼠肾包膜下，术后20天处死大鼠，免疫组化检测肾脏细胞存活及细胞凋亡情况，认为SC对共移植的肾脏细胞具有保护作用，其表面FasL特异性诱导移植物中浸润淋巴细胞凋亡，阻断细胞毒性T细胞、迟发性超敏反应T细胞对移植物的杀伤作用，使受体在局部产生对异体肾脏细胞的免疫耐受，并与共刺激通路阻断剂细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白有协同效应[15]。
　　3.5 SC对共移植的肝脏细胞的保护作用：肝功能衰竭可直接威胁生命。Tony等[16]将Wistar大鼠的SC与人的HepG2肝细胞系形成微囊后，移植于产生肝损伤后48h的Wistar大鼠或正常大鼠腹腔内，术后1周及4周取材，了解细胞生存情况，发现在正常动物组，空微囊在1个月后仍能保持完整，但有少许炎细胞浸润。而单独肝细胞移植组，微囊在1周时完好，但4周时微囊破裂，仅有少量细胞存在，胞质内空泡明显。在微囊周围及微囊内部白细胞反应严重。而肝细胞与SC共移植的微囊，在1周及4周时微囊均完好，细胞健康，活力好，白细胞浸润少见。肝细胞保持正常细胞结构，包含丰富的细胞器，包含大量高尔基体，内质网及紧密连接，而SC胞质内包含有大量脂滴，均表明肝细胞及SC功能良好。而在急性肝坏死模型中，1周时，肝细胞组仅残留少量细胞，细胞损伤严重，白细胞浸润明显，电镜下胞质中空泡明显，细胞内结构损伤，而共移植组的肝细胞显示正常结构。但到1个月时，单独肝细胞组白细胞浸润及纤维化明显，微囊与周围组织粘连。而共移植组，已形成明显的包含胆小管的肝结节，但SC结构不清。综上所述，空微囊组结果好于单独肝细胞组，但不如共移植组。作者认为空微囊可引发细胞因子介导的免疫支持反应，抑制TNF-α的局部产生。而急性肝坏死模型中共移植组在4周后仍有正常有活力的肝细胞存在，同时纤维化也是最少的，表明SC对共移植的肝细胞有保护作用。作者发现共移植组的血清中TGF-β的水平明显升高，应用抗TGF-β抗体可抑制免疫耐受的产生，而SC与肝细胞体外培养时FasL免疫细胞化学为阴性，应用抗FasL抗体不能抑制免疫耐受的产生。因此作者认为:①共移植物的免疫耐受与FasL的表达无关，而与TGF-β的作用密切相关，与Suarez的[17]观点相同，认为当肝细胞表达Fas，而SC表达FasL时，SC可引发肝细胞凋亡，而不是保护肝细胞的幸存；②SC可能通过免疫支持而起保护共移植细胞的作用，刺激肝细胞生存和增殖；③分泌IL-6、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF）等抗炎性因子，保护共移植细胞的生存。
　　有学者认为FasL的生物学活性是移植物获得免疫耐受的关键，移植物在遭到排斥之前完成FasL的更新，便可以重新获得免疫耐受的能力。Takeda的实验在术后2、4、6天腹腔内注入抗FasL单抗，成功阻断了FasL的生物活性，导致移植失败，也恰恰证明FasL完整有效持续性的表达是移植物存活的关键。但也有学者研究发现FasL的表达并不是SC促进异体、异种移植物的成活的关键。Cell等[18]将罗非鱼的胰岛细胞移植入行脲链霉素引发的糖尿病Balb/c小鼠体内，实验分三组，一组为FasL阴性的SC与胰岛细胞形成微囊共移植，一组为FasL阳性的SC与胰岛细胞形成微囊共移植，而另一组为单独胰岛细胞。SC的移植数量为7×106。术后监测血糖，结果发现第一、二组胰岛细胞存活时间明显较第三组长，表明共移植支持细胞可延长胰岛细胞异种移植的生存率，但第一、二组之间无明显差异，表明FasL的表达与SC增强异种移植生存率的关系并不明显。
　　由此可见，虽然对于SC能促进共移植物的免疫耐受也普通被接受，但关于Fas／FasL系统的免疫保护作用存在两种截然相反的意见，部分实验取得了肯定的结果 ，同时也出现了相反的结论。Toumeur等[19]认为出现此种情况可能与下列因素有关：①不同的移植物对Fas诱导的细胞死亡的敏感性不同；②不同组织的细胞产生的可溶性FasL不同，而可溶性FasL可以抑制中性粒细胞的活动；③ FasL的促炎或抗炎结果受不同组织的局部环境因子所影响，中性粒细胞趋化因子出现了不同水平的表达。
　　
　　4小结
　　
　　尽管Fas/FasL系统的免疫保护作用受到质疑，但SC对共移植物具有明显的免疫保护作用是不容质疑的。SC对神经细胞的保护作用，已应用于临床治疗帕金森氏病、中风等。因此，SC可介导移植物的局部免疫耐受的特性，对器官移植具有重要意义。
　　
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　　[收稿日期]2008-04-23 [修回日期]2008-06-27
　　编辑/李阳利