鼻软骨【体外培养兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性变化及其临床意义】

　　[摘要]目的:探讨体外培养的不同年龄兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下增殖活性的变化,从而为鼻软骨牵张术前正畸矫治唇腭裂伴发鼻畸形提供理论依据。材料与方法:将第4代体外培养的新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞置于细胞膜式静态牵张应力施加装置上培养,流式细胞仪检测5kPa静态牵张应力在0～12h内对兔鼻软骨细胞增殖活性的影响。结果:0～10h内5kPa静态牵张应力组软骨细胞增殖指数随着静态牵张应力作用时间的延长不断上升, 对体外培养兔鼻软骨细胞具有较大的促增殖作用,增殖指数峰值位于10h处;5kPa静态牵张应力对体外培养的新生兔兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用。结论:5kPa静态牵张应力可促进体外培养的新生及六周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性,提示我们鼻软骨牵张术前正畸方法不仅适用于临床矫治新生儿唇腭裂伴发鼻畸形,而且有可能用于矫治1岁左右婴儿甚至更大年龄患儿的唇腭裂伴发鼻畸形,从而为唇腭裂伴发鼻畸形的矫治开辟一条新的方法。
　　[关键词]静态牵张应力;兔鼻软骨细胞;增殖活性;流式细胞术
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)08-1152-04
　　
　　Clinical Significance of tension force on proliferation of rabbit nasal chondrocytes in vitro
　　BAI Ming-hai1, WU Han-jiang2,ZHANG Ting-ting3,JIANG Cui-chang1,LING Tian-you2
　　(1.Department of Orthodontics,Changsha Stomatology Hospital, Changsha 410005,Hunan,China;2.Department of Stomatology,Xiangya Second Hospital,Central South University,Changsha 410011,Hunan,China;3.Department of Laboratory,Xiangya Second Hospital,Central South University,Changsha 410011,Hunan,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the effects of tension force on proliferation of rabbit nasalchondrocytes in vitro and its clinical significance.Materials and MethodsThe fourth-passage chondrocytes were harvested from the nose of neonatal and 6-week-old rabbits. A continuous static tension force was applied on the cells in vitro using a cellular static tension force device, and the proliferation of nasal chondrocytes were examined using a flow cytometry. The experimental group were divided into seven groups under continuous 5 kPa static distraction for 0 to 12 hours. ResultsThe results showed that the proliferation of nasal chondrocytes was promoted as the application time of 5kPa static tension force was prolonged (0～10 hours).The maximal proliferationappeared, when the nasal chondrocytes were cultured under 5kPa continuous static tension force for 10 hours (P 　　1.2 实验材料:Ⅱ型胶原蛋白酶(上海生工公司),胰蛋白酶(Sigma公司,美国),DME M培养基(Sigma公司,美国), 胎牛血清(杭州四季青生物公司),聚苯乙烯一次性培养瓶,皿,板(Falcon公司,美国),新生及六周龄纯种新西兰白兔(中南大学湘雅二医院动物室提供),医用硅胶膜(化工部有机硅中心,成都),医用耐酸不锈钢及常规细胞培养实验器械等。
　　1.3 细胞膜牵张力施加装置(四川大学生物力学研究所提供):细胞膜式牵张力施加装置如图1所示。将体外培养的细胞种植于硅胶膜上,通过硅胶膜密闭隔开细胞培养小室与液压小室,利用液体静张力使膜发生弹性形变,贴附于膜上的细胞受到相应牵张力。通过调节液体的液面差,可以较准确控制实验所需的牵张力。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1新西兰白兔兔鼻软骨细胞培养及鉴定:兔鼻软骨原代细胞传代培养到第4代,每天常规在倒置相差显微镜下观察兔鼻软骨细胞在培养瓶及硅胶膜上的培养性状和形态学特点。采用甲苯胺蓝染色和免疫组化检测Ⅱ型胶原表达方法鉴定兔鼻软骨细胞。
　　1.4.2培养小室及硅胶膜处理:本实验所用硅胶膜厚约0.2mm,直径38mm,将硅胶膜放入75%酒精浸泡24h,去除可能的其他化学成分,三蒸水反复漂洗后浸泡12h,组装不锈钢整体培养小室,整体高温,高压(121℃,0.1 MPa,25min)灭菌。
　　1.4.3细胞力学实验前准备:将第3代培养的兔鼻软骨细胞传代,0.25%胰酶消化后,按2×105个/孔的密度接种于培养膜上,培养膜上预先加入5%胎牛血清DMEM培养液2ml,于 CO2培养箱内(37℃,含95%空气,5% CO2)培养,培养15h后,用PBS液洗3次,加入15%胎牛血清的DMEM培养液,依据相关实验方案进行实验。
　　1.4.4实验方案:分别测定第4代体外培养新生及六周龄新西兰白兔鼻软骨细胞(70份样本)在5kPa牵张力作用下培养(15%胎牛血清浓度)0,2,4,6,8,10,12h后DNA含量(以0h为对照)(流式细胞仪)。样本量均为5个。
　　1.5 流式细胞仪检测:在培养膜加入适量0.25%胰酶,室温下消化15s 左右,4℃ PBS漂洗,离心(4 000r/min,4min 各一次),收集鼻软骨细胞;5ml 80%酒精固定保存于塑料离心管,流式细胞仪检测细胞增殖活性(北京鼎国生物公司)。细胞增殖活性以增殖指数(proliferative index,PI)表示,先检测各细胞周期表,然后按以下公式计算:
　　1.6统计分析:所有数据输入SPSS 13.0软件包进行组间方差分析。
　　
　　2结果
　　2.1 体外培养兔鼻软骨细胞培养和鉴定:硅胶膜表面生长的软骨细胞形态正常,具有典型多角样细胞形态特征,并可见正在分裂增殖的细胞;静态牵张应力刺激培养下硅胶膜上兔鼻软骨细胞呈多角形的伸展状态,细胞整体形态被拉伸。所培养的细胞经甲苯胺蓝染色和免疫组化检测Ⅱ型胶原表达结果为阳性,鉴定为软骨细胞(图2)。
　　2.2 新生及六周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性变化:从表1可见,0～10h内5kPa静态牵张应力组软骨细胞增殖指数随着牵张力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于10h处,12h处PI指数下降;静态牵张应力对体外培养的新生及6周龄兔兔鼻软骨细胞均有促增殖作用,但对体外培养的新生兔兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用。
　　
　　3讨论
　　3.1 选择静态牵张应力值的依据:郭欣[5]等报道,膜式细胞牵张力施加装置符合体外细胞应力加载的要求,操作方便,性能可靠,可长时间稳定运行,已在多种细胞体外加力实验中得到应用。本课题的预实验观察到在5kPa荷载下硅胶膜变形率分别为8%,且在这种张应力条件下兔鼻软骨细胞始终贴壁生长,体外培养鼻软骨细胞增殖活性均有改变,因此根据膜式细胞牵张力施加装置特性及预实验结果,初步选用5kPa大小的牵张力。
　　3.2 体外培养兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下的增殖活性变化及其临床意义:有学者从细胞分子水平对软骨细胞做了相关研究,结果表明:不同大小牵张力作用下均可导致软骨细胞的增殖活性变化[6-8]。本实验发现牵张力实验组与对照组有显著统计学差异(P 　　[2]Maull DJ, Grayson BH, Cutting CB, et al. Long-term effects of nasoalveolar molding on three-dimensional nasal shape inunilateral clefts[J].Cleft Palate Craniofac J,1999,36(5):391-397.
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　　[收稿日期]2010-05-28[修回日期]2010-07-12
　　编辑/张惠娟