【利用RNAi技术下调VEGF表达对血管瘤内皮细胞的影响】 角膜内皮细胞

　　[摘要]目的：培养人血管瘤内皮细胞（HemECs），利用RNA干扰技术下调HemECs 中VEGF的表达，观察其对血管瘤内皮细胞的影响。 方法：利用组织块法培养HemECs，鉴定、筛选和纯化后，分为A、B、C三组，分别为转染组、空脂质体组和对照组。利用脂质体法将pGCsiU6/Neo/dsRED-VEGF真核表达质粒转染到内皮细胞中。通过荧光显微镜大体观察转染效率和细胞生长情况、ELISA法检测细胞分泌VEGF蛋白和MTT法检测质粒转染对HemECs的影响。 结果：转染组第五天转染细胞达到总细胞80%以上，但是细胞凋亡逐渐增加。第七天细胞稀少，漂浮死细胞增多。转染阳性细胞减少，细胞整体状态差。转染组培养上清中VEGF蛋白浓度在转染的第1、3、5、7天分别为141.3±7.82、92.34±5.71、68.07±5.95及40.65±6.71pg/ml。MTT法检测各组490nm的OD值在1、3、5、7天均有统计学差异（P＜0.05）。 结论：转染后的细胞活性降低，通过对其分泌的VEGF蛋白的测量发现，转染组VEGF蛋白明显下降，同时，细胞活力受到影响，漂浮的死细胞增多。这些都可以说明，VEGF在血管瘤内皮细胞生长、增殖之中起着非常重要的作用，这也为我们治疗血管瘤提供一个新的靶点。
　　[关键词]RNAi，血管瘤内皮细胞，VEGF，细胞转染
　　[中图分类号]R732.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）01-0089-04
　　
　　Effect of down-regulated VEGF by RNAi on the HemECs
　　MA Ge-jia,YI Cheng-gang,LIU Bei,YANG Li
　　(Institute of Plastic Surgery,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveDown regulating the VEGF by RNAi in the cultured HemECs to detect its effect on HemECs.MethodsCulturing HemECs though the tissue explants adherant method,after identification,screening,and purification,dividing the HemECs into A,the transfection group,B,the mock,and C the control group,using liposome to transfect pGCsiU6/Neo/dsRED-VEGF into epithelial cells,and analysis the efficacy of transfection and thecell proliferation by fluorescent microscopy,testing the VEGF secretion level by ELISA and HemECs proliferation by MTT after transfection.Results The tranfected cells in group A occupied over 80% overall cell on the fifth day,at the same time the apoptosis of cells increased,and on the seventh day these was a few cells left,the fluorescent positive cells decreased, the cell overall situation was weak. The VEGF level in the culture supernatant by ELISA was 141.3±7.82、92.34±5.71、68.07±5.95 and 40.65±6.71pg/ml after the transfection day 1、3、5、7 respectively. MTT assay showed that the OD value after the transfection the day 1,3,5,7 was statistically significant (P＜0.05).ConclusionThe cell activity decreased after RNAi fragment transfection,the VEGF secretion level in the culture supernatant in the transfection group decreased compared with the other two groups. Meanwhile the cell activity had been effected, the dead cells increased. All these results suggested that the VEGF have played very important role on the growth and proliferation of HemECs, this also provides a good target for cure hemangioma.
　　Key words:RNAi;HemECs;VEGF;cell transfection
　　
　　血管瘤是婴幼儿常见的皮肤肿瘤，好发于头面部和四肢等体表部位，也可发生于肝、脾等内脏器官[1]。其发病机理还不清楚，但血管内皮细胞的非控性增生被认为是引起血管瘤增殖的主要原因。目前大部分学者认为这些增生是血管形成刺激因子或抑制因子水平异常引起的。其中VEGF被认为与血管瘤的生成、发展和消退有着重要的联系[2]。我们利用基因干扰技术，通过体外实验研究，下调婴幼儿血管瘤血管内皮细胞中VEGF基因的表达，观察血管瘤和血管瘤内皮细胞的发展变化。将VEGF作为一种新的治疗靶点，同时探讨血管瘤的增殖和消退机制，为进一步临床应用研究奠定理论基础。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 血管瘤标本来源：瘤体组织标本来源于我科1 例近期瘤体生长迅速的5个月女性患儿背部的增生期血管瘤。病理学检查光镜下见肿瘤组织位于真皮层内，无明显包膜，由大小不等的变形毛细血管内皮细胞及其形成的管腔构成，腔内可见红细胞，局部有的内皮细胞成团，尚无管腔形成。
　　1.2 HemECs细胞的培养和鉴定：利用组织块法[3-4]培养血管瘤内皮细胞。在超净工作台内用PBS液反复冲洗标本，仔细去除皮肤和皮下组织，将标本剪成约1mm×1mm×1mm的小碎块，然后接种于培养瓶底，间距约5mm。轻轻翻转培养瓶，将接种有组织块的瓶底朝上，加入M199培养液（美国Gibco公司）内含20%胎牛血清（美国Gibco公司），内皮细胞生长支持物100μg/ml (Endothelial cell growth supplement，ECGS，美国Sigma公司)，放入含5%CO2、37℃培养箱中培养，4～6h后慢慢翻转培养瓶，使培养液缓慢覆盖组织块，注意不要让组织块漂起。大约3～4天有细胞开始从组织块周边移出，1周后游出细胞混合成片，部分汇合成岛状，在显微镜下确认细胞岛，在培养瓶背面用标记笔画出范围；在超净工作台内用细胞刮小心刮除圈外的细胞。细胞铺面80%瓶底时就可传代，用0.25%胰蛋白酶消化，待细胞皱缩呈球形后加入培养液轻轻吹打，使其成细胞悬液，按1:2接种于培养瓶，继续培养。用Ⅷ因子免疫组化染色和透射电镜观察检测。
　　1.3 实验分组和细胞转染：将细胞培养于6孔板中（共3块），待细胞融合约80%时进行转染，细胞采取随机的方法分为3组，每组6个孔，分别为：A:脂质体Lipofectamine2000（美国invitrogen公司）介导的质粒转染组；B:空脂质体组；C:空白对照组。质粒的转染按照说明书推荐比例进行，我们选用的是质粒：脂质体为1:5，转染时用无血清培养基，转染24h后换成含胎牛血清的培养基。
　　1.4 细胞观察和检测：质粒载体带有红色荧光标记，所以我们在转染后利用倒置荧光显微镜进行观察。双抗体夹心ABC-ELISA法（深圳晶美生物工程有限公司）检测细胞分泌的VEGF蛋白的表达，VEGF浓度与OD值成正比，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，可通过标准曲线求出标本中VEGF浓度。MTT法检测质粒转染对HemECs的影响，在酶标仪上选择490nm波长，测定各空的吸光值。
　　1.5 统计学分析：数据采用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS12.0版统计软件对数据进行统计和方差分析，P＜0.05，有显著性差异。
　　
　　2结果
　　2.1 细胞培养和鉴定：在显微镜下观察，接种后大约3～4天有细胞从组织块周边游出，内皮细胞呈多角形，边界清楚，核成圆形或者椭圆形。混杂的成纤维细胞成长条的梭状。大约一周内皮细胞大量游出，汇合成片，但是部分被成纤维细胞包围形成内皮细胞岛。经过多次的机械刮除，成纤维细胞数量减少，生长受到抑制。内皮细胞快速增殖，细胞较大，常有2～5个核仁。去除组织块后继续培养，可见细胞连接成片，大约4周细胞铺满瓶底，出现典型的“鹅卵石”样形态。当铺满瓶底大概80%时，可以按1:2传代。细胞大概能传3～4代，随后细胞增殖减慢，生长状态差，凋亡加速，不能再传代。培养细胞经Ⅷ因子免疫组化染色后可见细胞胞浆中出现棕黄色颗粒，细胞内存在第Ⅷ凝血因子相关抗原（Factor Ⅷ related antigen，vWF），电镜观察见细胞胞浆内有少量核蛋白体、粗面内质网、溶酶体等。胞浆内还见一种短棒状小体，含平行管状的内部结构，即Weibel-Paldae小体，是内皮细胞特征性的结构。说明培养的细胞为内皮细胞(图1)。
　　2.2转染后大体观察质粒转染效果：利用倒置荧光显微镜观察发现：对照组细胞生长正常，空脂质体组发现有少部分细胞死亡，漂浮在培养液内，剩下细胞生长缓慢，但是随着时间延长，细胞逐渐恢复正常。通过倒置荧光显微镜观察，转染组第一天脂质体转染效率不高，细胞有凋亡。第三天转染细胞逐渐增多，成活细胞状态稳定。第五天转染细胞达到总细胞80%以上，但是细胞凋亡逐渐增加。第七天细胞凋亡率较空白对照组达到65%以上，细胞稀少，漂浮死细胞增多。转染阳性细胞减少，细胞整体状态差（图2）。
　　2.3VEGF蛋白表达：转染稳定后，我们调整各组细胞数，随后进行VEGF蛋白的测定。A组（转染组）培养上清中VEGF蛋白浓度在转染的第1、3、5、7天分别为141.3±7.82、92.34±5.71、68.07±5.95及40.65±6.71pg/ml；B组（空脂质体组）培养上清中VEGF蛋白浓度在转染的第1、3、5、7天分别为169.73±6.75、162.64±6.03、157.24±5.76、159.57±6.28pg/ml；C组（对照组）培养上清中VEGF蛋白浓度在转染的第1、3、5、7天分别为215.37±5.76、221.35±6.65、224.96±5.34、223.18±5.57 pg/ml。A组与B、C两组间的比较有统计学意义（P＜0.01）；B、C两组之间统计学也有差异（P＜0.05）（图3）。
　　2.4MTT法检测质粒转染对HemECs的影响：A组与B、C组490nm的OD值在1、3、5、7天均有统计学差异（P＜0.05），这说明下调VEGF基因对细胞的增殖和存活有着直接的影响。B、C两组490nm的OD值在1、3、5、7天也有统计学差异（P＜0.05），这说明脂质体对细胞也具有一定的毒性作用（表1）。
　　3 讨论
　　婴幼儿血管瘤是最常见的儿童良性肿瘤，女性患儿比男性患儿多见，早产儿比足月儿多见。它是由杂乱无章的血管和不成熟的血管内皮细胞组成[5]。最近研究发现对血管瘤及体外培养血管瘤内皮细胞的分子生物学特点有了进一步了解[6]。但其确切发病和消退机制仍不得而知。因此血管瘤的治疗方法有很多，但是疗效却不确切。
　　VEGF是到目前为止，发现的最强的促血管生成的蛋白。在正常的人体内分布广泛，在无明显新生血管形成的心、肾、脑等部位也有不同程度的表达，这些可能与VEGF维持该部位血管正常功能有关。正常内皮细胞本身并不表达VEGF，其只是VEGF的靶细胞。在敲除VEGF基因的小鼠中发现有心血管的异常和血管的缺陷[7]。早期研究发现，VEGF在增殖性血管瘤标本和血管瘤内皮细胞（HemECs）中大量表达[8-9]。然而，有的实验却显示在增殖性血管瘤标本和HemECs的培养中VEGF的表达并没有升高，而VEGF的受体表达增高。同时，有实验发现血管瘤的间质细胞能够分泌VEGF[10]。这样相反的结论可能是因为在应用免疫印记的检测方法时，血管瘤间质细胞分泌的VEGF和血管瘤血管内皮细胞的VEGF受体相结合[11]，所以难以区分。
　　人们还发现增殖期血管瘤病人血清中VEGF的含量远远高于消退期病人和正常人。同时，也有研究发现接受完激素治疗的病人VEGF的表达明显低于治疗前[12]。Takahashi等[13]利用免疫组化技术检测了各个时期血管瘤标本中的VEGF，发现VEGF在增殖性血管瘤中表达增高，从而提出了VEGF与增殖性血管瘤形成有关。另外，有动物实验也证实转染VEGF基因可以在动物体内形成血管瘤[14]。有实验研究发现[15]并证实了微环境VEGF浓度升高决定着是正常的血管化还是形成血管瘤，而不是总的VEGF浓度。
　　血管瘤内皮细胞的成功培养和分离鉴定，为体外研究血管瘤提供了便利，作为利用瘤体培养的内皮细胞，它还具有其它内皮细胞所不具备的功能，为我们进一步了解和探索血管瘤的机制提供良好的平台。有学者[16]对体外培养的血管瘤内皮细胞进行研究发现，其增殖和迁移率要比正常的内皮细胞高2～3倍。同时它的增殖和迁移还和VEGF及其受体有关[17]。同时有实验表明，在培养的血管瘤内皮细胞中加入适量的VEGF，可以刺激内皮细胞的增殖。这些为我们在体外培养血管瘤内皮细胞来研究血管瘤的机制提供了良好的参考依据。我们运用VEGF的RNA干扰质粒，并培养了血管瘤内皮细胞，利用下调血管瘤内皮细胞的VEGF基因表达，来调控细胞的生长和凋亡。在试实验中运用脂质体作为载体，把干扰基因带入细胞内。我们发现受到转染的细胞活性降低，通过对其分泌的VEGF蛋白的测量发现，转染组VEGF蛋白明显下降，同时，细胞活力受到影响，漂浮的死细胞增多。这些都可以证明，VEGF在血管瘤内皮细胞生长、增殖之中起着非常重要的作用。
　　通过本实验我们利用RNAi技术有效的阻断靶基因的表达，同时这也是未来治疗血管瘤的一个新的途径。在血管瘤研究中，特意的阻断VEGF表达，能够起到一定的治疗作用，具有很高的特异性。在未来，不管是对血管瘤的进一步研究还是初步的试验性的治疗，RNA干扰技术都是一个行之有效的工具。
　　
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　　[收稿日期]2010-10-24 [修回日期]2010-12-28
　　编辑/张惠娟