聚羟基丁酸酯可吸收缝线生物相容性的实验室研究:羟基丁酸

　　[摘要]目的:研究聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate,PHB)可吸收缝线的生物相容性。方法:①将成纤维细胞进行体外培养,传代后与PHB可吸收缝线复合培养,设与经聚氰基丙烯酸酯处理过的PHB可吸收缝线复合培养为对照组,观察细胞生长情况;②行扫描电镜检查观察细胞在丝线上的生长情况;③以MTT法检测复合培养后的细胞活性。结果:①实验组细胞生长良好,对照组细胞漂浮,收缩成团;②扫描电镜下见细胞在丝线上贴附生长良好;③MTT法检测实验组对细胞增殖无明显影响。结论:PHB可吸收缝线具有良好的生物相容性。
　　[关键词]可吸收缝线; 聚羟基丁酸酯;成纤维细胞
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)04-0531-03
　　
　　Investigation of the biocompatibility of polyhydroxybutyrate absorbable suturein laboratory
　　WU Jin-hua1,LIU Bin1,AI Yu-feng2,YANG Qing-fang3,DONG Zhao-lin4
　　(1.Department of Burn and Plastic, Xi"an Central Hospital,Xi"an 710003,Shaanxi,China; 2.Sichuan Huamei Zixin Medical Cosmetology Hospital; 3.Polymer materials,Northwestern Polytechnical University University; 4.College of Life Science, Northwest University)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the biocompatibility of absorbable suture made of Polyhydroxybutyrate (PHB).MethodsThe fibroblast were co-cultured with PHB suture verse fibroblast co-cultured with PHB suture which had been dipped in the cyanoacrylate sdhesive(for cytotoxicity),the proliferation and the adhering conditionare observed by inverted microscope and scanning electronic microscope,Culture fibroblast inculture plates containing PHB suture,investigate the attachment rate with MTT assay.ResultsThe number of fibroblastincreased co-cultured with PHB,and the comparison cellswere floated and shrinked,by scanning electronic microscope,there were cellsconnect each other adhering on the surface ofthe suture.ConclusionPHB have fine biocompatibility with fibroblast.
　　Key words: absorb suture;polyhydroxybutyrate;fibroblast
　　
　　1 材料和方法
　　1.1 试件:实验所用PHB可吸收缝线为西北大学生命科学院和西北工业大学理学院应用化学系联合研制,分子量为1.5×105～2.0×105,纯度99%,菌种为园褐固氮菌G-3,纤维纤度0.04～0.18dtex。
　　1.2 仪器:BB16型CO2培养箱 (Heraeus,上海),SW-CJ-1B型超净工作台( 苏净集团),倒置显微镜(Olympus,Japan),低温冰箱( SANYO),0.22μm、0.45μm微孔滤膜(Sigma),S-520扫描电镜(HITACHI,Japan), DG5031型酶联免疫检测仪,LG10-3A低温高速离心机(北京医用离心机厂)。
　　1.3 试剂:小牛血清(FBS杭州四季青生物有限公司),DMEM培养液 (GIBCO公司),胰蛋白酶 (Sigma),MTT(Sigma),bFGF ( Sigma)。
　　1.4 方法
　　1.4.1成纤维细胞的培养:采取组织块贴壁法进行成纤维细胞培养。原代培养:在手术室无菌条件下将手术切下的瘢痕组织小心去除表皮及皮下脂肪组织,生理盐水反复冲洗,在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 1～2mm3的小块,加入少量小牛血清,接种于40ml培养方瓶中,组织块间留约0.3～0.5cm的间距,在95%空气,, 5%CO2,37℃,饱和湿度条件下培养24h,使组织块牢固贴附于瓶壁。 然后加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液继续培养,一周后取出培养瓶,弃去瓶内培养液,Hank"s液漂洗两次后加相同的培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后,同样方法每周换液两次。传代培养:待细胞生长基本融合成片时即可传代,吸出培养瓶内的培养液,Hank"s液漂洗两次,向瓶内加入0.5%的胰蛋白酶溶液少许以覆盖瓶底为度。大约1min左右,镜下观察细胞胞质回缩,细胞间隙增大时立即吸出胰蛋白酶液,加入DMEM培养液终止消化。用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞使之脱落形成细胞悬液,按1:3比例分装传代,加入足量的DMEM培养液后置于37℃恒温培养箱内培养。每周换液两次,待细胞融合成单层再次传代。
　　1.4.2 PHB可吸收缝线的制备:PHB可吸收缝线由西北工业大学用干法纺丝制得,其工艺参数为:纺丝温度:喷丝管温度为15℃～25℃;热空气温度为50℃～60℃;挤出速度: 0.04 ml/min;绕卷速度: 43.2m/min。拉伸温度:100℃;拉伸倍数:4～6倍;热定型温度:80℃;热定型时间:20～30min。
　　1.4.3 成纤维细胞和PHB可吸收缝线的复合培养
　　1.4.3.1 分组:①实验组:将PHB可吸收缝线剪成2cm长的线段,75%酒精浸泡消毒1h,捞出晾干后备用[1];②对照组:将PHB可吸收缝线剪成2cm长的线段,先浸于75%酒精消毒1h,再浸于聚氰基丙烯酸酯(细胞毒性物质)溶液中[2],持续1h,捞出晾干后备用;③空白组:仅作单纯细胞培养。
　　1.4.3.2 方法:取生长良好的第3～4代成纤维细胞,胰酶消化、离心,调整细胞密度为4×107,接种于各组培养瓶中,实验组5瓶,对照组5瓶,空白对照组5瓶,细胞生长至接近铺满时终止培养,倒置显微镜下照相。
　　1.5 MTT法检测成纤维细胞在PHB材料上的粘附率及成活、增殖能力
　　1.5.1分组:①A组:bFGF+PHB可吸收缝线+成纤维细胞;②B组:PHB可吸收缝线+成纤维细胞;③C组:成纤维细胞。
　　1.5.2方法:取4块96孔板,将PHB可吸收缝线剪成约2mm长的线段,按照分组置于A组和B组孔中,取第3代成纤维细胞调整细胞浓度至1×104个/ml,接种100μl于各孔中,每组复种10孔。分别于第1天、第3天、第5天、第7天各取1板,用MTT法检测细胞增殖情况,具体方法:先吸出孔内培养液,重新沿侧壁缓缓加入DMEM(含10%FBS)200μl,然后再加入MTT(5mg/ml)20μl,继续培养4h,然后吸出孔内液体,每孔加入150μlDMSO,震荡10min,用酶联免疫检测仪在490nm波长检测各孔OD值。
　　1.5.3 统计学处理:各项均数以x±s表示,应用spass 10.0软件进行方差分析及相关检验。
　　
　　2结果
　　2.1成纤维细胞与PHB复合培养
　　2.1.1 倒置显微镜观察:实验组细胞生长良好,未见异常核分裂。PHB缝线周围的成纤维样细胞密集排列,生长良好(图1),对照组细胞漂浮,卷曲皱缩(图2),空白组细胞生长良好(图3)。
　　2.1.2 扫描电镜观察:成纤维细胞复合PHB可吸收缝线:可见一些连接呈网状的成纤维细胞附于PHB边缘(图4)。
　　2.2 MTT法检测成纤维细胞在PHB材料上的粘附率及成活、增殖能力见表1。
　　
　　3讨论
　　3.1 医用可吸收缝线是一种用于组织结扎、组织固定及伤口闭合的缝线,理想的手术缝线应具备:①在创面的愈合过程中能够维持足够的强度;②创口愈合后可自行降解吸收;③不产生炎症反应;④无刺激性及致癌性;⑤易于染色、打结、灭菌等。随着科学的进步及外科手术的发展,缝线的研究已成为研究的热点,目前,美国ETHICON公司已提供出一整套完整的可吸收缝线,而我国自己能够在医院广泛应用的可吸收缝线只有羊肠线一种,其生产工艺落后,对人体组织刺激反应大,吸收差[3-4]。为了适应现代医学发展的需要,本课题组合作研究开发出了具有自主知识产权的生物可降解材料---聚羟基烷酸(PHB),在成功的将其作为组织工程的支架材料,应用于体外构筑组织工程血管,骨缺损修复、隆鼻材料等之后,现在又着力于PHB可吸收缝线的研究,本实验则对PHB可吸收缝线的生物相容性进行初步研究,从而为下一步的动物实验及临床实验打下基础,以期生产出我们自己的可吸收缝线。
　　3.2 PHB的特性及生物相容性评价:为了获得具有更高的强度和更高柔韧性,又有留存断裂强度高、组织反应小和吸收性能好的缝合线,人们对聚酯类生物降解材料纺丝制得的缝合线的研究较为广泛[5]。PHB是原核微生物在营养失衡的情况下储存于细胞内的一种高分子聚合物,结构与性能不同于淀粉、纤维素、蛋白质、甲壳素等天然高分子,而更类似于化学合成的聚乙醇酸、聚乳酸聚已内酯等脂肪族聚酯,脂肪族聚酯的机械强度好,但在降解过程中开会产生局部炎症反应[6],而PHB因为由生物合成,所以有很好的组织相容性,且完全不含化工原料合成可能产生的有毒物质,降解产物β-羟基丁酸为人体血液固有成分,并可最终经酮酵解为CO2和H2O排出体外。是极洁净的生物塑料[7-8]。
　　汤苏阳、艾玉峰[9]等将PHB浸提液作为条件培养液体外培养L929小鼠成纤维细胞评价PHB的生物相容性,并将浸提液通过静脉注入大鼠体内及直接将材料埋植于大鼠皮下以观察其急慢性毒性反应。结果显示,PHB的细胞毒性为0级,组织相容性良好;体内实验证实其无毒,局部及全身组织学未见病理学改变。本实验将PHB与成纤维细胞进行体外复合培养,结果发现成纤维细胞可在PHB周围正常生长,保持其细胞形态,显示出良好的生物相容性。
　　3.3 MTT比色法[10](四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法):此方法是由Mosroam在1983年提出,最初应用于免疫学领域,后将该法应用于生物材料的细胞毒性评价,该方法的原理是在被检细胞中加入MTT后,活细胞的线粒体脱氢酶可将MTT还原并产生紫色结晶物,由于结晶物形成量与活细胞数成正比,通过光比色测定OD值可间接反映细胞生长及增殖活性,此方法简便、快速、灵敏,且结果稳定可靠[11]。
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2009-10-27 [修回日期]2010-03-10
　　编辑/张惠娟