[周期性牵张应力对人成骨细胞基因表达谱影响的初步研究]应力性骨折可以自愈吗?

　　[摘要]目的：研究周期性牵张力对人成骨细胞基因表达谱的影响，为进一步研究机械应力状态下骨改建机理提供思路和线索。方法：通过体外细胞加载系统对培养的人成骨细胞施加8％形变率、6周/min的周期性牵张力24 h，应用基因表达谱芯片技术对人成骨细胞中的mRNA表达水平进行对比杂交分析，检测周期性牵张力加载组成骨细胞基因表达谱的变化。结果：在所分析的21 073条人类功能基因中，加载组与未加载组人成骨细胞之间差异表达显著的基因有2 498条，其中表达上调的有899条(2.0倍以上),表达下降的有1 599条(0.5倍以下)。这些基因表达产物涉及细胞信号转导、细胞周期调节等多个方面。结论：周期性牵张力对成骨细胞多种基因的表达产生了影响，成骨细胞的应力反应是一个复杂的，多基因参与调控的过程。这些变化的基因可能与成骨细胞的机械应力反应有关。
　　[关键词]周期性牵张应力；人成骨细胞；基因表达谱；基因芯片
　　[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）10-1410-03
　　
　　Experimental study of effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts
　　QIU Jun,LI Yong-ming,LIN Zhu,CHEN Qiao-ling
　　(Department of Orthodontics，College ofStomatology,the Fourth Military Medical University，Xi"an 710032，Shaanxi，China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo study effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts in vitro.MethodsHuman osteoblasts were cultured on flexible-bottomed plates and subjected to 8% elongation by strain unit at 6 cycles/min (i.e.5-s elongation and 5-s relaxation) for 24 hours in the experimental groups. Control group were not exerted any strain. Both of them were examined by gene expression profiles chip technology. Results A series of differentially expressed genes were found between experimental group and control group. 899 up-regulated and 1599 down-regulated genes were identified among the 2 498 differentially expressed genes.ConclusionThe results shows that the response ofhuman osteoblasts to cyclic tensile strain in gene level was complicate. These differentially expressed genes are necessary genes related to osteoblasts response to mechanical strain.
　　Key words:cyclic tensile strain；human osteoblast；gene expression profile； gene chip
　　
　　成骨细胞(Osteoblast)是一种对应力敏感的细胞，来自多潜能的间充质干细胞，负责骨基质形成及钙化,在骨改建过程中起重要作用。大量研究表明[1-5]：成骨细胞在应力状态下，细胞活力、新陈代谢以及与细胞成骨有关的骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、表皮生长因子受体(epidermal growth receptor，EGFR)、细胞外基质等发生变化。但是以往的研究多限于一个或几个分子基因，难以全面系统地了解成骨细胞对机械力刺激的反应模式。因此，本研究利用基因表达谱芯片技术，比较全面地分析牵张应力条件下人成骨细胞功能活性的影响因素，研究周期性牵张力对人成骨细胞基因表达谱的影响，为进一步研究机械应力状态下骨改建机理提供思路和线索。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1主要试剂和仪器：DMEM培养液(Gibco，美国)；新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；TRIZOL 试剂(Invitrogen,美国)；Agilent 人1A基因表达谱芯片（Agilent，美国）；cRNA扩增与标记试剂盒（Lifegen，美国）；芯片杂交试剂盒（Agilent，美国）；RNA纯化试剂盒(Qiage，美国）；芯片扫描仪（Axon 400B，美国）；Genepix3.0软件(General Scanning，美国)；多通道细胞牵张应力加载仪（第四军医大学口腔医学院）；6孔弹性膜培养板(Flexcell，美国)。
　　1.2 人成骨细胞培养及鉴定：经患者及其家长同意，取一名14岁女性儿童因正畸需要拨除下颌第三磨牙牙胚时去除牙槽骨块约0.5～1.0g，将组织放于盛少量小牛血清的培养皿中，用眼科剪剪碎成约1mm3大小。按酶消化法原代培养人成骨细胞，通过活体观察、碱性磷酸酶(ALP)染色、骨钙素免疫组织化学染色法鉴定所培养细胞为成骨细胞，取第5～8代细胞进行实验。
　　1.3 加载周期性牵张力：将第5代成骨细胞按1.5×105／孔接种到两块6孔弹性膜培养板上，培养24h，细胞在弹性膜底贴壁牢固，生长至约80%底壁面积，换含2%新生牛血清的DMEM培养液静置24h，再次换含2%新生牛血清的DMEM培养液。其中一块6孔弹性膜培养板作为实验组，应用多通道细胞牵张应力加载仪对培养在弹性膜培养板上的成骨细胞施加6周/min、8%形变率的周期性牵张力24h后收集细胞。另一块6孔弹性膜培养板作为对照组不加载机械力，在相同条件下培养24h后收集细胞。
　　1.4基因表达谱芯片分析分别取实验组与对照组人成骨细胞，加适量TRLzol匀浆，离心10min。取上清液加入氯仿，震荡后放置3min，向上清液中加异丙醇充分混匀再离心10min。加入两次75%乙醇离心弃上清，加入RNAse-free超纯水完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。经预杂交后加入逆转录引物合成cDNA ,以Cy5标记实验组细胞cDNA，Cy3标记对照组细胞cDNA做探针，纯化后在Agilent Human 1A基因表达谱芯片上进行杂交。冲洗玻片晾干后以Axon 400B扫描仪扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件Genepix3.0对扫描图像进行数字化处理和分析。判断基因差异表达的标准为：①Cy3和Cy5信号比值的自然对数的绝对值(Ratio)>0.69(基因的表达变化在2倍以上)；②Cy3和Cy5信号值其中之一必须大于800。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 总RNA提取结果：人成骨细胞总RNA凝胶电泳可见mRNA 18S、28S条带清晰（如图1）。紫外分光检测分析显示，实验组与对照组人成骨细胞总RNAOD260/OD280>1.9，说明提取RNA的纯度和完整性达到要求。
　　
　　2.3 基因芯片杂交信号散点图（如图3）：分别以参加比对两组数据的对数值（Ln）作为横纵坐标作图，以散点分布趋势直观判断两组数据的差异状况，沿45°对角线方向分布的基因，表示它在两样本中的表达量是相同的。距离对角线垂直距离越远的基因，表示它在某一样本中的差异表达程越大。设R=S/ C（S代表纵坐标上归一化后的样本数据，C代表横坐标上归一化后的样本数据），其中红色的点代表R≥2，即S相对C表达上调大于2倍的基因，绿色的点代表R≤0.5，即S相对C表达下调小于0.5倍的基因，蓝色的点表示0.5