[小儿毛细血管瘤的非线性光谱成像研究] 多光谱成像仪

　　[摘要]目的：探讨非线性光谱成像方法在临床上用于无损探测、实时监测小儿毛细血管瘤的病理生理过程，追踪其病程发展过程，以及评估治疗效果的潜力。方法：选取58例资料完整的小儿皮肤毛细血管瘤（颌面部）手术切除标本，其中增生期（2～12个月）26例，消退期（2～5岁）16例,消退完成期（6～11岁）16例。将样品切成30μm厚度，进行非线性光谱成像分析, 相应的正常皮肤做为对照。结果：正常皮肤与不同时期毛细血管瘤组织中的胶原蛋白和弹性蛋白纤维的含量、形态结构和光谱特性存在明显差异。结论：基于双光子激发荧光(Two-Photon Excited Fluorescence，TPEF)和二次谐波产生（Second Harmonic Generation，SHG)相结合的非线性光谱成像技术有可能成为临床上用于无损探测、实时监测小儿毛细血管瘤的病理生理过程，追踪其病程发展过程，以及评估治疗效果的有力工具。
　　[关键词]非线性光谱成像；毛细血管瘤；正常皮肤；胶原蛋白；弹性纤维
　　[中图分类号]R732.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1093-05
　　
　　Nonlinear spectral imaging for capillary hemangioma among children
　　XIONG Shu-yuan,ZHUANG Jing,YANG Jin-gu
　　(Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou,350005,Fujian,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the potential of nonlinear spectral imaging method for Non-destructive detection and monitoring of the pathophysiology of capillary hemangioma among children and for tracking the process of development of them as well as for assessment treatment responses in clinic.MethodsSelected 58 cases with complete data in skin capillary hemangioma of children ,which 26 cases (2～12 months) in proliferative phase, 16 cases (2～5 years) in resolution phase, 16 cases (6～11 years) in complete regression period .All of the tissue section samples of 30 lm thickness were analyzed by the use of a nonlinear spectral imaging system, normal skin in the control group. ResultsThere are significant differences between different phase of capillary hemangioma tissue and normal skin in terms of their morphological structure and the spectral characteristics of collagen and elastic fibers. ConclusionsNonlinear spectral imaging based on TPEF / SHG may be used for non-destructive detection and real-time monitoring in the pathophysiological process of capillary hemangioma, tracking the course of the development process, as well as a powerful tool for evaluating treatment effects.
　　Key words:nonlinear spectral imaging；capillary hemangioma ；normal skin；collagen；elastic fibers
　　
　　毛细血管瘤是小儿最常见的良性肿瘤之一，虽然部分血管瘤可自行消退,但某些位于重要部位及难治性的血管瘤在其消退前常严重影响相应器官的功能，甚至危及生命。因此需积极进行干预和治疗。目前临床上治疗毛细血管瘤的方法很多，但治疗效果并不令人满意，随着对毛细血管瘤研究的不断深入，人们一直在努力寻找治疗血管瘤的最佳办法以及干预措施，而传统对病变过程及治疗效果的监测都是依靠临床经验，因此基于双光子激发荧光和二次谐波信号的非线性光谱分辨成像这种非侵入式活体定量检测技术研究血管瘤的病理生理改变、追踪增值退化演变过程，并能够对血管瘤的治疗过程进行实时监测以及对疗效进行客观地分析和评估，是十分必要且非常有意义的。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 按照Takahashi分类法[1]以及HE 染色后根据组织结构进行病理分期：胞质内管瘤组织20%以上部位有纤维变性或血管腔闭塞者为消退期，无上述组织结构改变者为增生期血管瘤。选取58例资料完整的小儿皮肤毛细血管瘤（颌面部）手术切除标本，其中增生期（2～12个月）26例，消退期（2～5岁）16例,消退完成期（6～11岁）16例。取相应的正常皮肤做为对照。标本来自于福建医科大学附属第一医院整形小儿外科。标本切下后，立即存放于-196℃液氮罐里直至使用。将样品切成30μm厚度，并把每片切片夹于载玻片于盖玻片之间。所有组织切片样本均进行非线性光谱成像分析。在整个成像过程中，为了避免样品的脱水和收缩，将PBS溶液（pH 7.4）喷洒于样品表面。
　　1.2 实验原理装置及图像、光谱分析：非线性光谱成像系统由一架倒置显微镜(Axiovert200，Zeiss LSM 510META)和一架美国相千公司生产的锁模钛宝石飞秒激光器(110fs，76MHz，波长范围700～98Onm)组装在一起；扫描显微系统:主要是由xY扫描器和步进马达(HRZ200，Zeiss)组成。所有图像为512×512像素，并有12位像素深度。本实验使用两种不同的渠道获取正常皮肤和不同时期毛细血管瘤组织中胶原蛋白和弹性蛋白的高对比度图像，一个通道对应于414～436 nm波长范围内，以显示组织中胶原蛋白倍频信号，而另一种通道对应于457～714nm波长范围内，在激发波长为850nm时显示弹力纤维。利用以成像为导向的光谱分析方法，通过绘制不同感兴趣区域内所有像素的平均强度与每个发射波段的中心波长来获得光谱，并记录和分析光谱。
　　1.3 统计分析：实验数据的计量资料以x±s表示，采用成组t检验及LSD-t检验。采用SPSS16.0统计软件分析。
　　
　　2结果与分析
　　2.1 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤中胶原蛋白和弹性纤维的高对比度成像及3D图像：图1、2在正常皮肤和不同时期毛细血管瘤组织中，胶原蛋白和弹性纤维的含量及形态结构有很大的差异。毛细血管瘤血管周围基质中胶原蛋白含量多，密度大，弹性纤维形态不完整、断裂，分布不均、排列极度紊乱（图1a、图2ABC），随着病程发展，消退期毛细血管瘤组织（图1b、图2DEF）周围胶原蛋白含量较增生期有所减少，密度也明显变小，病程进展至消退完成期时，病变组织周围基质中胶原蛋白含量较前更为减少，弹性纤维形态趋近完整，极少出现断裂现象，分布及排列已具有一定的方向和规律（图1C、图2GHI），正常皮肤样品中弹性纤维呈现为外形完整，排列有序，分布均匀一致（图1D、图2JKL）。激发波长为850nm下，在414～436nm波长范围内，二次谐波产生（SHG）提取到胶原蛋白图像（绿色编码），457nm到714nm波长范围内，双光子激发荧光（TPEF）成像提取到弹力纤维图像（红色代码）。
　　2.2 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤中胶原蛋白的光谱信息：图3基于TPEF和SHG相结合的非线性光谱成像的最大优势是同时获取染色标本的图像和光谱，这一特点能提供组织更准确，更全面的生理和病理信息。图3显示了图1中所对应的不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织中胶原蛋白的发射光谱图像，而发射光谱的强度是评价其含量的重要指标：增生期、消退期、消退完成期毛细血管瘤组织中胶原蛋白SHG信号强度分别约为正常皮肤的1.6倍（图3A）、1.3倍（图3B）、 1.1倍（图3C），相对应的，增生期、消退期、消退完成期毛细血管瘤组织中胶原蛋白SHG含量分别约为正常皮肤的1.6倍、1.3倍、1.1倍。
　　2.3 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织的光学信息：图4使用胶原蛋白SHG信号的深度依赖衰减常数可定量评估不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织中胶原蛋白分布排列特点。图4显示了不同时期小儿正常皮肤与毛细血管瘤组织中胶原蛋白的深度依赖衰减常数。正常皮肤中胶原蛋白深度依赖衰减常数（0.039±0.008）明显小于增生期毛细血管瘤组织的值（0.062±0.005）(0.001 　　3.6 根据不同时期毛细血管瘤组织和正常皮肤中，弹性纤维的微观形态、排列、分布及其结构所呈现出的巨大不同可以推断：在毛细血管瘤组织中弹性纤维体积减少可能是由于病变导致皮肤真皮层弹性纤维网变性、损伤，并且大量增生的胶原纤维，分割弹性纤维，直到病程发展到消退完成期，病变组织逐渐纤维化并自行愈合。
　　3.7 另一方面，不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织中胶原蛋白的发射光谱特征提供了更为精确的信息，这也说明了在血管形成及血管瘤的病理演变过程中，胶原蛋白和弹力蛋白作为构成细胞外基质的主要结构蛋白，起着关键作用，与病变发展密切相关。在毛细血管瘤的病程发展过程中（增生期-消退期-消退完成期），组织中胶原蛋白的含量也随之发生动态改变：逐渐减少，直至正常。这一结果也证实了胶原蛋白与愈合、组织纤维化有一定的关系，其含量可预示血管瘤的退化。
　　3.8 将正常皮肤和增生期毛细血管瘤组织中胶原蛋白和弹性蛋白纤维光谱测量与显微图像结合起来，对弹性纤维直径和细微结构进行分析，可以更加准确地获得毛细血管瘤病变组织的生理和病理信息。并且，应用这种无损的检测方法实时监控疾病的演变过程，在治疗过程中通过及时检测评估治疗效果，更好了解治疗机理并正确选择治疗方案，可以更为有效的评估治疗效果，为小儿毛细血管瘤的临床诊断与治疗提供客观、准确的依据。可能实现对婴幼儿毛细血管瘤形成、发展及其消退机制的更加深入的研究，达到阻止血管瘤发生或促进血管瘤消退的目的。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2011-03-15 [修回日期]2011-05-25
　　编辑/张惠娟