绿色荧光标记共培养睾丸体细胞体内\外培养观察:用32p标记玉米体细胞

　　[摘要]目的：对Wistar大鼠睾丸间质体细胞转染携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒，为进一步标记睾丸间质体细胞移植组织工程实验奠定基础。方法：获取Wistar大鼠睾丸间质体细胞，用慢病毒转载绿色荧光对其转染标记，体外培养，在共聚焦荧光显微镜下动态观察细胞生长、增殖等情况。回植于去势鼠体内，培养一定时期后取心脏血进行雄激素的检测。结果：睾丸间质体细胞于90h后，在荧光显微镜蓝光激发波长下，可发出明亮的绿色荧光，转染率达80%。传代后的细胞仍能发出明亮的绿色荧光。回植后血清学检测有明显高于对照组的激素检出。结论：经GFP转染后的睾丸间质体细胞仍具有睾丸间质体细胞的特性。采用携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒标记睾丸体细胞中梭形及不规则形细胞（SLCs等）转染细胞效率高且持久、简便有效，且能保持睾丸间质体细胞原有生物学特性。
　　[关键词]绿色荧光；共培养睾丸体细胞；细胞标记
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0608-05
　　
　　Detection of the culture in vitro of the co-cultured testis somatic cells and GFP labeling
　　LI Ming1,XU Feng2,XU Hong-xia1,WANG Xiao-yun3,FAN Xing4,BI Hong-da3,XING Xin3
　　(1.Department of Plastic Surgery, Navy General Hospital,Beijing100037,China;2.Nuclear of Shanghai Ninth People"s Hospital Affiliated Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China;3.Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital Affiliated The Second Military Medical University Shanghai 200433,China;4. The Institute of Plastic Surgery,PLA of The Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveGreen fluorescent protein(GFP) are nanoparticles which have strong fluorescence intensity and more are resistant to photobleaching thanorganic fluorescence probes in cell biology and biomedicine. In this report, we labeled it with GFP for the co-cultured testis somatic cells.MethodsWe got seed-cells labeling with GFP. We cultured the labeled cells and went down to the future generation. We observed it by the micrscope. Assay the serum testeosterone level of the transplanted rats by heart puncture.ResultsThe co-cultured testis somatic cells labeled with GFP were easy to label. The GFP in the cells were brighter, more stable. The GFP in the cells were inherited by the daughter cells. Conclusion GFP labeling opened up new possibilities for monitoring of the co-cultured testis somatic cells. Especially for stem Leydig cells, SLC, Progenitor Leydig cells, PLC. And can remain its proper biological characteristics
　　Key words: green fluorescent protein (GFP); the co-cultured testis somatic cells; cell labeling
　　
　　新兴的组织工程技术为组织、器官缺损及激素分泌下降等方面的患者带来了希望和福音。组织工程技术,其基本原理是将少量种子细胞经体外扩增后与生物载体结合，在体内或体外构建具有一定形态和生理功能的组织甚至器官。要了解作为种子细胞的睾丸间质体细胞移植后在体内的生物学行为（如迁移定植、分布、增殖、分化和激素的分泌等），离不开睾丸间质体细胞的示踪和定量技术。传统的标记方法随着标记时间的延长和细胞分裂次数的增加，标记物会逐渐减弱甚至消失，不利于移植细胞的示踪和细胞分化的研究。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)在紫外光或蓝光激发光下可自发地发射内部绿色荧光，在普通显微镜下即可观察出[1-2]。绿色荧光蛋白标记具有表达稳定、方便检测及不影响细胞功能等优点。从而被广泛地应用于示踪移植干细胞在体内的定植、分布、含量、分化及转归等方面的研究[3-4]。在前期研究中，依据Leydig细胞贴壁迅速的特性建立了一种简易快速的Leydig细胞分离技术[5]。后又经研究用差速贴壁法获取睾丸间质细胞。近期有研究表明经差速贴壁法获得的睾丸间质体细胞群中含有Leydig干细胞（Stem Leydig cells,SLCs）、前体细胞（Progenitor Leydig cells, PLC）及成熟的Leydig细胞，前体细胞向LC定向分化后，开始特征性表达3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD），但其增殖能力逐渐降低，至成熟LC时已完全丧失有丝分裂能力。因此，干细胞和前体细胞是成熟LC生理性更新的重要来源[6-9]。使得睾丸间质体细胞具有激素分泌及分化潜能，SLCs在体外培养过程中逐渐分化成成熟Leydig细胞，实现激素可持续性分泌[10]。是雄激素分泌组织工程构建的理想种子细胞。本实验通过携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒转染睾丸间质体细胞，为进一步标记睾丸间质体细胞移植组织工程实验奠定基础。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料及试剂
　　1.1.1实验动物：3周龄、体重50～56g雄性近交系同基因wistar大鼠，中国科学院上海实验动物中心提供。
　　1.1.2试剂和药品：DMEM/F12(1:1)购自Gibco公司；胎牛血清（FCS）购自（美国，Hyclone）；携带GFP的慢病毒(第二军医大学长海医院朱吉博士惠赠)；胰蛋白酶、胎牛血清等其它化学用品(购自美国Sigma公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)；CO2孵箱 (美国，Forma)。
　　1.2 细胞的培养及GFP标记
　　1.2.1 Wistar大鼠睾丸间质体细胞的分离及培养：无菌条件下切取3周龄wistar大鼠的睾丸组织，去除白膜，和可见血管，将睾丸组织剪碎，0.3%复合胶原酶NB4与组织量按5:1比例，于37℃恒温摇床内消化至睾丸形状基本消失，曲细精管断裂，加两倍量的PBS稀释。经150目滤网过滤，1 500r/min离心5min，沉淀细胞，37℃、5%CO2、95%O2和100%湿度条件下，无血清DMEM/F12(1:1)培养24h，冲洗去除悬浮细胞，所得全部贴壁细胞即为共培养睾丸体细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。待细胞长满培养皿底，即可用0.25%胰蛋白酶消化，注意控制消化时间不超过2min，接着进行传代。
　　1.2.2 Wistar大鼠睾丸间质体细胞的GFP转染即慢病毒GFP转染睾丸间质体细胞：将培养的睾丸体细胞以0.25%胰酶蛋白酶-0.02%EDTA消化，制备单细胞悬液。将病毒液小心滴加之细胞上，轻轻混匀。置于37℃，5% CO2、95%O2和100%湿度培养箱中孵育4h，离心，弃去转染液，将细胞按2.5×106的密度进行接种于经0.1%明胶包被的新培养皿内，加2ml加有血清DMEM/F12(1:1)培养基继续培养48～90h。荧光倒置显微镜观察、拍照,常规培养、传代。
　　1.3标记后的睾丸间质体细胞回植：将转染标记好的睾丸间质共培养细胞复合于生物材料支架上回植于去势鼠（事先制备并饲养一定周期）体内，进行一定时间的体内培养。
　　1.4 雄激素的检测：抽取回植了转染了GFP的睾丸间质体细胞的去势鼠的血液，离心后取用血清，经Access全自动免疫分析系统(RIA，微粒子发光原理)(Beckman C0ulter，USA)测定睾酮水平。
　　
　　2结果
　　2.1 Wistar大鼠睾丸间质体细胞的GFP转染：原代培养的睾丸间质细胞中LC呈长梭形或是圆形，核大，胞质少，类似石榴籽状。SC呈长柱状或三角形，有突起，折光性强。LC干细胞呈纺锤形、梭形或不规则形；慢病毒转染后的共培养睾丸间质细胞中成熟的LC逐渐减少，反之梭形、不规则形，中间折光性强的细胞比例相对增大(图3)。选择激发波长为488nm、发射波长507nm荧光显微镜下，GFP转染48h、72h、90h后的共培养睾丸间质细胞中的干细胞均贴壁生长良好，折光性好，呈纺锤型、梭型或不规则形，细胞膜光滑完整，胞质丰富，核轮廓清晰，细胞增殖速度无明显改变；而圆形，核大，胞质少，类似石榴籽状的LC细胞进一步减少，崩解。荧光显微镜下，转染48h可观察到荧光表达，但强度稍弱（图2）；72h后荧光显微镜下可见细胞呈贴壁状态，开始发出较强的翠绿色荧光（图4）。90h后大多数细胞发出明显绿色荧光，呈“全细胞型”，即胞质和胞核弥漫性分布，表达强者，荧光呈翠绿色，有的区域可见数个聚集在一起的荧光细胞(图5)。传代后仍然是以梭形及不规则形细胞贴壁生长良好，而圆形类石榴籽状细胞较少且不健康，要么处于凋亡中（图6）。未转染GFP的对照组细胞未见绿色荧光。收集转染标记好的睾丸间质共培养细胞复合于生物材料支架上，细胞浓集后发出翠绿色荧光，可间接通过回植时散落的细胞团观察(图7)。
　　2.2 Wistar大鼠睾丸间质体细胞的转染效率：随机计数4个低倍视野中显微镜及转换荧光观察的同一视野中的细胞数量，计算90h荧光转染效率为80%。
　　2.3标记后的睾丸间质体细胞回植：回植后实验鼠成活良好，进食、睡眠等如常，未观察到死亡或其它异常行为。
　　2.4 血清学检测：血清学检测仍有明显高于空白对照回植的雄激素表达。
　　
　　3 讨论
　　3.1 GFP基因转染睾丸间质体细胞的示踪作用：GFP是从水母中分离出来的一种具有自发荧光的小分子蛋白质[11]，具有性质稳定、易于构建融合蛋白且融合蛋白仍能保持荧光活性、易于检测、检出率高和无细胞毒性等优点。因此已成为检测体内基因表达及失踪完整活细胞生命现象的重要标记物，在生物医学领域应用日益广泛[12]。本实验希望用GFP标记目的细胞--睾丸间质体细胞。前期实验证明睾丸间质体细胞共培养能提供一个由细胞外基质、细胞因子及细胞间的相互接触形成的稳定的组织微环境，这对发育阶段Leydig细胞数量和功能维持都具有重要支持和调节作用[13]，而成熟Leydig细胞分泌雄激素是主要的功能细胞。许多研究证实，成熟的LC为终末分化细胞，不具备有丝分裂能力，其在体数量的维持主要依靠LC的干细胞（stem Leydig cells, SLC）及前体细胞（Progenitor Leydig cells, PLC）[6-9]。并且有实验证明差速贴壁法获得的7天龄、3周龄大鼠睾丸间质细胞群中均含有Leydig干细胞（Stem Leydig cells,SLCs）SLCs在体外培养过程中逐渐分化，表达3β-羟基类固醇脱氢酶，并产生睾酮[10]。睾丸间质体细胞群中含有Leydig干细胞（Stem Leydig cells,SLCs）及成熟的Leydig细胞，使得睾丸间质体细胞具有激素分泌及分化潜能，SLCs在体外培养过程中逐渐分化成成熟Leydig细胞，实现激素可持续性分泌。对于构建一块能回植于体内、可持续地分泌雄激素的组织来说意义深远。为此，本实验应用慢病毒介导将GFP基因转染睾丸间质体细胞，使其携带示踪标记。并将标记好的细胞附着于一定材料的复合物上回植于事先制备好并培养一定时期的去势鼠体内。通过检测其生物学特性、转染率以便了解其转染后的功能与转归。标记成功与否以细胞是否发出翠绿色荧光为准，同期通过空白对照排除其它因素引出的非转染造成的荧光。收集转染GFP基因的睾丸间质细胞回植入体内时培养皿散落的细胞团，可见翠绿色细胞团，由于细胞团呈立体球形，镜下只能清晰地看到某一层面的细胞。其余模糊的绿色也是转染GFP的细胞，说明经过收集、离心等过程的操作，转染后的细胞性能稳定，仍具较强的绿色荧光。更进一步说明回植入体内的细胞为标记绿色荧光后的大鼠睾丸间质共培养细胞。激素检测转染GFP后的睾丸间质体细胞回植鼠的血清，有明显高于对照组的激素检出，说明经GFP转染后的睾丸间质体细胞仍具有睾丸间质体细胞的特性，GFP基因并未影响其中相关细胞激素的分泌。而在GFP转染睾丸间质体细胞结果说明说明在睾丸间质体细胞中的梭形细胞（SLCs等）转染细胞效率高且持久。但对于铺展开的呈石榴籽状的细胞即成熟的LC则不能标记，且有使细胞崩解，凋亡的作用。
　　3.2 本实验中慢病毒载体的优、缺点：本实验以原代培养的睾丸间质体细胞作为靶细胞进行转基因标记研究，采用慢病毒载体实现了外源性基因的转染，提示GFP基因已经转染到睾丸间质体细胞内，并有效表达。实验观察到GFP成功转染的细胞多为梭形的未完全分化成熟的细胞，而成熟的铺展开的呈石榴籽状的细胞则崩解，凋亡。我们将标记好GFP的种子细胞回植于体内，回植后实验鼠成活良好，进食、睡眠等如常，未观察到死亡或其它异常行为，从血清学检测中发现有高于空白对照组的激素分泌。说明，慢病毒载体在某种程度上会损伤发育成熟的睾丸间质细胞，但对未发育成熟的细胞不但不影响它的分化、还能成功标记。我们使用GFP作为标记基因，相应的编码蛋白能在荧光显微镜下显示特异性的荧光，由此作为确定基因转染成功与否的根据。所以相对其他标记研究方法，本实验操作更简便，一旦标记成功性状稳定，更能直观的观察实验结果。但存在选择性标记（成熟的睾丸细胞无法标记）、标记过程相对较慢，因为基因转染后，蛋白的表达仍需时间。慢病毒GFP转染有一定细胞毒作用，不适用于成熟的有分泌功能的LC，但适用于梭形SLCs，且回植后不影响它的分化及之后的激素分泌。可采用一定方法将成熟LC及梭形SLCs分开，将筛选出的类干细胞及前体细胞进行绿色荧光标记，对成熟的LC以量子点标记，标记成功后将其混合共培养，再回植，既不影响成熟LC生长、分泌，又能在体内检测相应细胞的转归。或者筛选出类干细胞及前体细胞进行绿色荧光标记，标记成功后诱导并促其向成熟细胞发育，然后回植于体内培养，希望可以达到体内长期存留标记细胞的作用。甚至我们可以利用慢病毒GFP转染的细胞毒作用，使其天然的破坏成熟细胞而仅仅留下类干细胞及前体细胞并标记，去进行此类别更细化的细胞的相关研究。转染围绕慢病毒展开基因标记，仍有许多问题有待研究，如慢病毒的毒性作用、转归，对宿主细胞的影响。等具体细节问题需要进一步认识后方能广泛地应用。
　　
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　　[收稿日期]2010-11-26 [修回日期]2011-03-18
　　编辑/张惠娟