上颌骨翼上颌缝【上颌骨内置式持续等张缝牵引成骨机制的实验研究】

　　[摘要]目的:通过对山羊颧上颌缝持续等张缝牵引成骨来延长上颌骨复合体,探讨缝牵引成骨的机制。方法:在山羊两侧颧上颌缝安置自主设计制作的内置式微型自动持续等张缝牵引器,缝两侧钛钉标记,术后定期拍摄X线片,并在4、6、8周切取牵引和未牵引的颧上颌缝及新生骨组织,进行组织学观察。采用免疫组化染色方法研究标本中bFGF、TGF-β1、VEGF的表达和变化。结果:在牵引力的作用下,所有山羊上颌骨复合体均成功前徙。在牵引6周时出现软骨细胞团,细胞团之间有新生骨小梁形成。间充质细胞、成骨细胞及骨细胞中bFGF、TGF-β1、VEGF均有不同程度的阳性表达或阳性表达增加,呈时间和空间上的变化。结论:经缝牵引成骨的成骨机制以膜内成骨为主,但也有软骨成骨;bFGF、TGF-β1、VEGF以及3种胶原均参与了缝牵引成骨的成骨过程,促进了间充质细胞向成骨细胞的增殖、分化及新骨的改建。
　　[关键词]缝牵引成骨;上颌骨复合体;软骨成骨;膜内成骨;生长因子
　　[中图分类号]Q813.1R782.2[文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)06-0852-05
　　
　　Experimental studies of isotension continuous sutural distraction osteogenesis mechanism on maxillary complex
　　LI Yan,SHI Ze-hong,YIN Ning-bei, DU Ming-juan,FANG Lin,SHI Bing-bing,ZHANG Lei,ZHAO Zhen-min
　　(The First Department of Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China)
　　
　　Abstract: ObjectiveTo study the mechanism of bone formation by observing the histology changes and bFGF、TGF-β1、VEGF expressions in zygomatico-maxillary suture and new bone tissue.MethodsUse goats as experimental animals, several self-designed internal nickel-titanium shape memory metal braces were placed on maxillary surface,by taking X-ray regularly after operation to show the exact distances that maxilla moved. Then the new bone and suture tissue were obtained in 4weeks,6weeks and 8weeks after distraction to observe the histology changes and collagen changes through microscope. The expressions ofbFGF、TGF-β1、VEGF were investigated by means of immunohistochemistry.ResultsAll goats" maxillary complex advanced successfully. Six weeks after distraction, the newborn cartilage cell group appears, and between the cartilage cell group there were forming new bone trabeculas. bFGF、TGF-β1、VEGF expressed in all groups and varies with distracting time.ConclusionsCartilaginous osteogenesis participate in bone formation in the sutural tissue. On the surface of the maxilla, main mechanism of bone formation is intramembranous osteogenesis,bFGF、TGF-β1、VEGF and all three types of collagen take part in the bone regeneration.
　　Key words:sutural distraction osteogenesis;maxillary complex;cartilaginous ossification;intramembranous ossification;growth factors
　　
　　缝牵引成骨(Sutural distraction osteogenesis,SDO)是在截骨牵引(Distraction osteogenesis,DO)基础上发展起来的一种微创、疗效确切的矫治颅面骨骼畸形的治疗方法,对颞骨研究表明[1]其缝牵引成骨机制为膜内成骨,而对于上颌骨复合体而言,其成骨方式有待进一步探讨。此外既往对截骨牵引研究发现[2-4],碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、转化生长因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在截骨牵引的新生骨组织中均有高水平表达,但是在缝牵引新生骨组织中这些因子以及胶原纤维的表达如何,目前国内报道较少。
　　本研究以山羊颧上颌缝牵引成骨模型为基础,采集骨缝及新生骨组织标本,探讨缝牵引中缝及新生骨组织中的细胞及胶原的变化规律和bFGF、TGF-β1和VEGF在间充质干细胞、成骨细胞和骨细胞中表达规律,初步探讨经缝牵引成骨的成骨机制。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料:3～4月龄健康成年中国山羊4只,3只牵引组1只对照组,雌雄不限,平均体重5kg(协和整形外科医院实验动物中心),速眠新、苏醒灵(北京三有兽用麻药公司),内置式微型自动持续等张缝牵引器,镍钛记忆合金材料,每个缝牵引器在压缩至18mm时可以产生1kg力量(与北京记忆公司合作研制),bFGF抗体、TGF-β1抗体(Santa Cuze公司),VEGF抗体(Zeta公司),PV6001试剂盒(美国GBI),天狼猩红染液、甲苯胺蓝染液(本实验室自配),BX51倒置显微镜(Olympus公司)
　　1.2 方法
　　1.2.1 手术操作:牵引组动物术前禁水、禁食12h,速眠新肌注麻醉。面部去毛、碘伏消毒, 眶下缘L形切口进入, 逐层切开至上颌骨, 显露颧上颌缝,于颧上颌缝两侧用打孔钻打6孔,每组2孔,横跨颧上颌缝,各组平行,间距10mm,颧上颌缝上下2孔间距离为18mm,将微型自动缝牵引器压缩后安置于骨孔内,每侧安装3个牵引器(每侧共产生3kg力量作用于与颧上颌缝),固定后于上颌缝两侧各植入钛钉一枚为标记,记录钛钉间距离,然后逐层缝合关闭切口。同法处理对侧。术后1周内肌注青霉素80万U,2次/日。常规精饲料圈养,术后7天拆线,于术后即刻、术后1周及术后3周做X线片检查以了解颧上颌缝扩张情况(图2)。
　　1.2.2标本处理:牵引组组分别于术后4周、术后6周、术后8周全麻下切取颧上颌缝及其周围骨性组织,对照组于术后4周取材,6%多聚甲醛液4℃固定24h、0.5mol 甲酸脱钙,修整标本,沿缝垂直向剖开,酒精逐级脱水,石蜡包埋,沿骨缝垂直向切取5μm 厚的连续切片,随机抽取部分切片HE染色、甲苯胺蓝染色、天狼猩红染色及免疫组织化学染色。1.2.3HE染色及特殊染色:蜡块纵向切片(5μm) , HE染色, 普通光镜观察缝及新骨组织形态、结构及再生修复情况。甲苯胺蓝染色,观察骨基质及成骨细胞情况。同时纵向切片(5μm) , 按文献[5]方法行饱和苦味酸天狼星红染色, 偏光显微镜观察缝及新骨组织中的胶原变化。偏光显微镜下Ⅰ型胶原纤维紧密排列, 呈较强的双折光性, 黄色或红色;Ⅱ型胶原纤维显示弱的双折光, 呈多种彩的疏松网状分布;Ⅲ型胶原纤维显示弱的双折光, 呈绿色的细纤维。观察时需在正交下进行。
　　1.2.4免疫组织化学染色bFGF、TGF-β1、VEGF:石蜡纵向切片(5μm),脱蜡至水,PBS浸泡2min×3次后高压抗原修复,3%H2O2室温孵育10～15min,蒸馏水冲洗PBS浸泡2min×3次,分别滴加一抗工作液:bFGF(1:150)、TGF-β1(1:250)、VEGF(1:60),4℃过夜,PBS冲洗2min×3次,滴加适当量PV6001,室温孵育30min,PBS冲洗2min×3次,DAB显色,自来水充分冲洗,苏木素复染,脱水透明,封片。细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为这三种生长因子的阳性信号。
　　
　　2结果
　　2.1 大体观察及X线片观察见图1、2。
　　2.2 组织学观察
　　2.2.1 HE染色:见图3。
　　2.2.2甲苯胺蓝染色:见图4
　　2.2.3偏振光显微镜观察:见图5。
　　2.3免疫组织化学染色:缝及新骨组织切片中bFGF、TGF-β1、VEGF免疫组化染色阳性信号的细胞定位与强度分级结果见表1。
　　bFGF在牵引过程中随着牵引时间均有增强趋势,间充质细胞中4周时出现阳性表达,8周开始减弱,成骨细胞中8周才开始增强,骨细胞中4周即开始增强,8周后仍未减弱,TGF-β1在间充质细胞中牵引后四周即开始强阳性表达,并一直维持到8周,成骨细胞和骨细胞中减弱为弱阳性表达,VEGF在间充质细胞和成骨细胞中牵引6周时表达为强阳性,骨细胞中VEGF在各组牵引过程中无变化,维持弱阳性表达。
　　
　　3讨论
　　缝牵引成骨通过牵张装置对骨缝施加特定大小的机械应力,激发骨组织自身生长潜力,从而达到增加骨量的治疗目的。在牵张力作用下,成骨速率可以达到儿童期骨自然生长率的4～6倍[6]。因此缝牵引被视作一种新的内源性组织工程(endogenous tissue engineering)技术。自从缝牵引成骨应用于颅面骨骼畸形矫正以来,临床上取得了显著的疗效,而缝牵引成骨由于其微创、无风险或风险小、作用范围广、能使整个上颌骨复合体得到延长、显著的矫正效果也越来越成为人们关注的热点,为儿童唇腭裂术后继发面中部发育不全的治疗提供了一个很好的手术方法,但是其成骨机制目前仍不十分明了。
　　牵引成骨术的骨形成机制一直是争议的焦点。Karp等[7]认为,狗下颌骨的牵引成骨机制主要为膜内骨化。Komuro等[8]证实,兔下颌骨新骨形成以膜内骨化和软骨内骨化两种方式同时进行。Sawaki等[9]研究认为,狗下颌骨牵引骨形成的主要形式为膜内骨化,部分区域可见纤维性软骨岛。骨发育过程中,软骨细胞、骨细胞和成骨细胞是三种主要细胞,Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的含量分别反映了软骨细胞和成骨细胞的成熟状况。胶原纤维,不仅起支架作用还影响着细胞的增殖与分化、骨质的形成与吸收以及骨基质矿化等, 机体通过胶原的合成分解和改建使骨修复得以完成和完善。本实验发现,上颌骨缝牵引过程中,三种胶原都存在,其含量随着牵引时间的延长而变化,6周时在HE切片上可以清楚地发现缝组织有软骨细胞团形成,其间有新生骨小梁,Ⅰ型胶原增多,Ⅱ型胶原逐渐减少;在甲苯胺蓝染色的切片上,牵引8周时,在骨膜下可以见到新骨形成,因此从本实验中可以推测,缝牵引中存在两种成骨方式:软骨成骨和膜内成骨,以膜内成骨为主,其中软骨成骨参与了骨缝组织的新骨的形成,而在骨膜下,均为膜内成骨,并且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原均参与了骨的形成和改建。
　　尽管缝牵引的成骨方式和骨改建过程与骨折修复有显著不同,但同样涉及一系列生长因子和细胞因子乃至激素的网络调节,其中骨生长因子在牵张后新骨再生中的作用可能非常重要。bFGF是一种广谱的有丝分裂原,主要由间充质细胞和成骨细胞合成,对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,并促进新生血管形成,加速软组织、软骨、骨组织及神经组织损伤的修复。此外,它不仅能刺激成骨样细胞表达TGF-β1,而且能诱导微血管生成,与其他骨和血管生成因子协同调控成骨活动。Tavakoli等[10]用牵张成骨术延长绵羊下颌骨后20天,发现bFGF呈稳定高水平表达。Okazaki[11]等通过注入外源性bFGF于兔胫骨牵张间隙内,发现bFGF有促进新骨生成的效应。TGF-β1广泛存在于正常组织细胞和转化细胞中,在体内能够诱导间叶细胞、成骨细胞、成软骨细胞及破骨细胞的增殖与分化,加速血管的生成,增加Ⅰ型胶原的合成,是骨吸收和骨形成之间有力的调节和偶联因子,并可抑制新破骨细胞的形成。TGF-β1可以直接刺激成纤维细胞外基质的合成,并对新形成的基质降解有显著的抑制作用,可刺激成骨细胞分泌几种骨基质蛋白,如纤维结合蛋白、蛋白聚糖和骨粘连素等[12-13]。此外它对其他激素及生长因子有调控作用,其中对VEGF有促进和抑制双向调节作用[14-15]。VEGF通过与血管内皮细胞上的受体结合,具有强大、特异性促血管内皮细胞增生和血管生成作用。其他因子的促血管生成作用全部或部分通过VEGF的作用得以实现。Spector等[16]发现VEGF对体外培养的成骨细胞无增殖的作用,但能引起成骨细胞迁移分化。Tsurumi等[17]将培养的人成骨细胞加入一定量的VEGF发现,成骨细胞对1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2D3)的合成作用明显增强。由于1,25(OH)2D3是钙合成所必需的,因此VEGF可能参与了成骨及骨塑形过程。金增强等[18]对犬进行面中缝牵引发现,骨缝中出现大量新生血管,受张力影响的上颌骨周围骨缝出现适应性重建。血管生成可以为骨再生提供充足的营养物质和代谢废物运输,为局部骨再生及代谢提供有利的微环境。
　　本研究中发现对照组中,除在间充质细胞中bFGF表达阴性外,其他因子在三种细胞中均有阳性或弱阳性表达,分析可能与我们所采用的动物年龄较小,正处于快速生长期有关。实验组山羊颧上颌缝及缝周新生骨组织中,除VEGF在骨细胞中表达不明显外,三种因子在三种细胞中均有程度不同的表达,且随着牵引时间变化而变化,牵引后4周在间充质细胞中bFGF出现阳性表达,TGF-β1同时出现阳性表达增强,VEGF阳性表达稍滞后于bFGF和TGF-β1,6周后表达增强,分析可能在持续等张的牵引力的作用下,缝组织中间充质细胞分泌bFGF增加,促进了间充质细胞的增殖与分化,同时bFGF水平的增高也促进了TGF-β1的分泌,共同诱导成纤维细胞、成骨细胞、成软骨细胞的增殖与分化,在TGF-β1的诱导下,VEGF的分泌增加,发挥特异性促血管内皮细胞增生和血管生成作用,为局部骨再生、改建及代谢提供了有利的微环境。同时在VEGF的作用下,1,25(OH)2D3的合成作用明显增强,局部钙摄取增加,为新生骨的改建提供了物质基础。在成骨细胞中bFGF于8周后阳性表达才开始增强,VEGF在6周即开始阳性表达,均滞后于间充质细胞,在骨细胞中,bFGF 4周开始强阳性表达,TGF-β1和VEGF阳性表达无增强或减弱,在我们的实验中发现,牵引8周后,TGF-β1及bFGF在间充质细胞和骨细胞中仍维持高水平的表达,阳性表达维持时间较截骨牵引长,且高水平表达出现时间也较截骨牵引晚,分析可能由于缝牵引没有截骨,对缝作用比较温和有关,其次由于采取了持续、等张的牵引力进行牵引,在持续、等张的力的刺激下,由于力的持续作用,导致了分泌细胞持续分泌TGF-β1及bFGF等骨形成因子,维持细胞中这些因子的高表达,促进骨再生与重建。其强阳性表达何时出现下降还需要进一步加以研究。
　　综上,通过本实验可证实,在缝牵引过程中,机械牵引力转变为生物分子信号,使骨缝组织细胞分泌bFGF、TGF-β1、VEGF等细胞因子,在细胞因子网络的调控下,骨缝间充质干细胞增殖、并向成骨细胞、成软骨细胞分化,通过膜内成骨、软骨内成骨这两种成骨方式形成新生骨组织。在成骨的过程中,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ三种类型的胶原均参与了成骨及改建过程,并随着牵引过程不断进行,其含量发生动态变化。
　　
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　　[收稿日期]2010-03-07 [修回日期]2010-04-25
　　编辑/张惠娟