STEAP3在脑缺血再灌注损伤沙鼠中的表达及意义

李晓蕾，李忠华，王鹏

（1.贵州医科大学第三附属医院实验中心，贵州 都匀 558000；
2.贵州医科大学第三附属医院神经外科，贵州 都匀 558000；
3.哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院生理学教研室，哈尔滨 大庆 163319）

脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤是缺血性脑卒中后一定时间内恢复或重建血液再灌注，使原有的缺血性损伤进一步加重的现象，与缺血性脑卒中后的致残率和死亡率密切相关［1］。脑I/R损伤可发生于缺血后数小时至数天，最终导致神经元损伤，与氧化应激、炎症反应等相关［2］。进一步明确脑I/R损伤的发生机制，制定有效的防治措施，是脑卒中研究有待解决的重要问题。铁离子广泛存在于脑组织中，脑缺血时脑组织中铁离子含量增加，神经元脂质过氧化，细胞死亡增多。研究［3］表明，铁代谢和脂质代谢调控信号异常均能导致铁死亡的发生，说明铁死亡在脑I/R损伤中发挥关键作用。前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）属 于STEAP家 族，是一种铁还原酶，在铁代谢过程中能够促进Fe3+还原成Fe2+，影响铁稳态、炎症、细胞增殖等过程［4］。研究［5］发现，敲除STEAP3表达通过抑制TAK1途径而减轻肝脏I/R损伤。然而，STEAP3在脑I/R损伤中的表达及其与铁死亡是否有关未见报道。本研究基于铁死亡，分析STEAP3在沙鼠脑I/R损伤中的表达及意义。

1.1 实验动物和分组

48只健康雄性蒙古沙鼠，体质量60～80 g，4～5月龄，由哈尔滨医科大学大庆校区机能实验室提供。动物饲养实验室温度（24±1）℃，湿度45%～70%。将48只沙鼠随机分为假手术组（Sham组）、I/R模型组（I/R组）、I/R模型+STEAP3小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）组（siRNA组）和I/R模型+scramble siRNA组（Control组），每组12只。

1.2 主要试剂

STEAP3和4-HNE购自英国Abcam公司；
H2AX购自美国Cell signaling公司；
谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）购自美国Santa Cruz公司；
GAPDH购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Nissl、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和Fe2+试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。STEAP3 siRNA和scramble siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，X-treme GENE siRNA转染试剂购自美国罗氏公司。

1.3 沙鼠脑I/R损伤模型的建立

沙鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉。麻醉后仰卧位固定，剪去颈部的毛，再剪开皮肤，分离皮下组织和肌肉，显示出两侧颈总动脉，使用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min。松开动脉夹，使脑血流恢复。Sham组不夹闭两侧颈总动脉，其他操作同I/R组。siRNA组和Control组沙鼠在手术前24 h分别尾静脉注射STEAP3 siRNA和scramble siRNA，其他操作同I/R组。

1.4 神经功能评分

建模后24 h，参考文献［6］进行神经功能评分：无症状，0分；
身体蜷缩或毛发凌乱，1分；
眼睑下垂，2分；
旋转行为，3分；
后肢外翻，4分；
痉挛，5分。分值越高，说明沙鼠神经功能损伤情况越严重。

1.5 Nissl染色

沙鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，断头取脑，分离海马组织，用于后续实验。每组随机选取6只沙鼠的海马组织，制成石蜡切片。切片脱蜡至水后，滴加Nissl染色液，37 ℃孵育10 min，蒸馏水洗3次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，10 min/次，中性树脂胶封片。

1.6 Fe2+和MDA水平测定

每组随机选取6只沙鼠海马组织，称重后用生理盐水制成10%的匀浆，离心后取上清。根据试剂盒说明书检测Fe2+和MDA水平。

1.7 Western blotting检测STEAP3、H2AX、4-HNE、GPX4蛋白的表达

收集沙鼠的海马组织，提取总蛋白，测定浓度。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭后，分别用STEAP3（1∶100）、H2AX（1∶100）、4-HNE（1∶200）、GPX4（1∶500）抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育，ECL显色成像。通过图像分析软件进行积分吸光度分析。

1.8 统计学分析

2.1 STEAP3在脑I/R沙鼠海马组织中的表达

采用Western blotting检测Sham组和I/R组沙鼠海马组织中STEAP3蛋白的表达。结果显示，I/R组STEAP3蛋白的表达高于Sham组（P＜ 0.05），见图1。提示STEAP3蛋白高表达可能与脑I/R损伤相关。

图1 Western blotting检测STEAP3蛋白的表达Fig.1 Expression of STEAP3 protein detected using Western blotting

2.2 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠神经功能评分的影响

脑I/R后24 h进行神经功能评分。Sham组沙鼠无神经功能缺损的症状，神经功能评分为0分；
I/R组沙鼠神经功能受到不同程度损伤，出现身体蜷缩、眼睑下垂、旋转行为、后肢外翻及痉挛等，神经功能评分为（3.58±1.24）分；
siRNA组沙鼠主要表现为身体蜷缩、毛发凌乱和眼睑下垂等，神经功能评分为（2.58±0.90）分；
Control组沙鼠表现与I/R组相同，神经功能评分为（3.50±1.09）分。I/R组神经功能评分明显高于Sham组（P＜ 0.01），与Control组比较无统计学差异（P＞ 0.05）；
siRNA组神经功能评分低于I/R组（P＜ 0.01）和Control组（P＜ 0.05）。

2.3 STEAP3干扰后脑I/R沙鼠海马组织中STEAP3和H2AX的表达

Western blotting检测沙鼠海马组织中STEAP3蛋白和细胞DNA损伤指标H2AX蛋白的表达情况。结果显示，I/R组STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表达明显高 于Sham组（P＜ 0.05，P＜ 0.01），siRNA组STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表达明显低于I/R组（均P＜ 0.01）和Control组（P＜ 0.05，P＜ 0.01），I/R组 与Control组 比较差异无统计学意义（均P＞ 0.05）。见图2。

图2 Western blotting检测STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表达水平Fig.2 Expression of STEAP3 and H2AX proteins detected using Western blotting

2.4 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马神经元损伤的影响

Nissl染色（图3A）显示各组沙鼠海马组织CA1区神经元损伤情况：Sham组神经元形态结构正常；
I/R组和Control组神经元轮廓模糊，部分神经元丢失；
siRNA组与I/R组比较，神经元数量增多，结构轮廓比较清晰。显微镜下计数各组海马组织CA1区神经元数量，结果（图3B）显示，I/R组神经元数量明显低于Sham组（P＜ 0.01），siRNA组神经元数量明显增多于I/R组和Control组（P＜ 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

图3 STEAP3对脑I/R沙鼠海马神经元损伤的影响Fig.3 Effects of STEAP3 on hippocampal neuron injury of gerbils with cerebral I/R

2.5 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马组织中GPX4蛋白表达的影响

GPX4为铁死亡相关蛋白，应用Western blotting检测各组沙鼠海马组织中GPX4的表达情况，结果（图4）显示，I/R组与Sham组比较GPX4蛋白表达明显减少（P＜ 0.01），siRNA组GPX4蛋白表达明显高于I/R组（P＜ 0.05）和Control组（P＜ 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

图4 STEAP3对脑I/R沙鼠海马组织中GPX4蛋白表达的影响Fig.4 Effects of STEAP3 on the expression of GPX4 protein in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R

2.6 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马组织中Fe2+的影响

应用Fe2+试剂盒检测沙鼠海马组织中的Fe2+，结果（图5）显示，I/R组与Sham组比较Fe2+水平明显升高（P＜ 0.01），siRNA组Fe2+水平明显下降，明显低于I/R组和Control组（P＜ 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

图5 STEAP3对脑I/R沙鼠海马组织中Fe2+水平的影响Fig.5 Effects of STEAP3 on the Fe2+ levels in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R

2.7 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马组织中4-HNE表达和MDA含量的影响

为了分析STEAP3对细胞脂质氧化的影响，首先应用Western blotting检测4-HNE蛋白的表达，结果（图6A）显示，I/R组4-HNE蛋白表达明显高于Sham组（P＜ 0.05），而敲除STEAP3后siRNA组4-HNE蛋白表达低于I/R组和Control组（P＜ 0.05），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。接下来应用MDA试剂盒检测MDA含量，结果（图6B）显示，I/R组脑组织MDA含量明显高于Sham组（P＜ 0.01），而siRNA组MDA含量明显低于I/R组和Control组（P＜0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 STEAP3对脑I/R沙鼠海马组织中4-HNE蛋白表达和MDA含量的影响Fig.6 Effects of STEAP3 on the expression of 4-HNE protein and MDA content in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R

脑是机体重要的器官之一，对缺氧的耐受能力差，缺血数分钟就会造成不可逆性损伤。但在缺血后一定时间内恢复脑血液灌注，会加重缺血脑组织不可逆性损伤［7］。脑缺血再灌注损伤与缺血性脑卒中后的致残率和死亡率密切相关，深入阐明脑I/R损伤的发生机制，能够为临床治疗提供重要参考，减轻再灌注导致的脑组织损伤程度。本研究发现，铁还原酶STEAP3在沙鼠脑I/R模型中高表达，敲除其表达可明显减轻脑组织损伤，说明STEAP3能够促进脑I/R损伤的发生；
通过检测铁死亡相关指标GPX4、Fe2+、4-HNE、MDA，发现脑I/R损伤中STEAP3可能通过铁死亡途径发挥作用。

短暂的缺血性低灌注可导致严重的急性脑损伤。脑组织再灌注过程中，多种复杂的机制可诱导神经元死亡，导致迟发性神经损伤。大量研究已经证实，在脑I/R引起的神经元损伤中，铁死亡是神经元死亡的主要形式之一。铁死亡是基于细胞内亚铁的细胞死亡方式，在生物化学、形态和遗传上与凋亡、坏死和自噬不同［8］，铁和氧化还原代谢的多种因素导致了铁死亡。

STEAP家族包括4个多通道膜蛋白，最初被报道为铁稳态调节因子，并已被确定参与许多细胞和分子事件，如细胞命运和炎症反应。STEAP3作为该家族的主要成员之一，已被证实参与了铁稳态、外泌体的组装和分泌、炎症等一些生物学过程［9］。本研究通过Western blotting检测沙鼠海马组织中STEAP3蛋白的表达，发现I/R组STEAP3蛋白的表达明显高于Sham组，提示STEAP3在脑I/R损伤中可能发挥一定的作用。为探究STEAP3的作用机制，造模前24 h给予沙鼠尾静脉注射STEAP3 siRNA（siRNA组）。siRNA组沙鼠神经功能评分和海马组织中DNA损伤指标H2AX 蛋白表达明显低于I/R组，Nissl染色也发现siRNA组海马CA1区神经元数量多于I/R组。这些结果说明，敲除STEAP3能够减轻脑I/R组织的损伤程度。

铁死亡的主要特点是铁依赖性，即细胞内游离铁增多，Fe2+提供了氧化过程所需的电子。贮铁蛋白降解释放和转铁蛋白转入增多等多种途径使大量Fe3+进入细胞内，细胞内Fe3+被还原为Fe2+，构成了体内不稳定铁池的来源，一方面通过芬顿反应直接导致脂质过氧化物增多，另一方面参与合成含铁酶类促发铁死亡［10］。STEAP3是一种铁还原酶，能够促进Fe3+还原成Fe2+。本研究证实，I/R组Fe2+增多，干扰STEAP3表达，siRNA组与I/R组比较沙鼠海马组织Fe2+水平明显降低，说明STEAP3能够影响脑I/R组织中Fe2+的水平。

GPX4被认为是铁死亡标志性蛋白，是一种将H2O2分解成水或相应醇的酶，GPX4活性降低可提高细胞质和脂质的活性氧水平，最终导致细胞铁死亡［11］。4-HNE蛋白表达和MDA含量被用来评价细胞内脂质氧化的水平。本研究也进一步证实，与Sham组比较I/R组GPX4蛋白表达减少，4-HNE蛋白表达和MDA含量增多；
而siRNA组与I/R组比较，GPX4蛋白表达增多，4-HNE蛋白表达和MDA含量减少。以上结果提示，STEAP3可能通过促进细胞内Fe3+还原为Fe2+，介导铁死亡，从而影响脑I/R损伤的发生和发展。

STEAP3是铁代谢有关的基因，与肿瘤等多种疾病有关。在肿瘤的研究中发现，STEAP3通过诱导间质转化、促进转铁蛋白受体表达和激活STAT3-FoxM1信号轴促进胶质瘤的进展［12］；
STEAP3通过阻滞细胞周期G1期，抑制肝癌细胞增殖［13］。在病理性心肌肥大的研究中发现，STEAP3可阻断Rac1依赖性信号级联的激活，是病理性心肌肥大的负调节因子［14］。STEAP3在肝脏I/R损伤中的作用已被证实，并通过TAK1介导JNK/p38途径发挥功能［5］。

综上所述，本研究证实了STEAP3在沙鼠脑I/R损伤中高表达，并通过介导铁死亡而影响脑I/R损伤的发生和发展，抑制其表达对脑I/R损伤具有保护作用。