lncRNA,ATP6V1B1-AS1对非小细胞肺癌增殖与侵袭的作用及其机制

李依霖，叶军，何连栋，王嘉俊，许顺

（中国医科大学附属第一医院胸外科，沈阳 110001）

肺癌是目前全球范围内第二高发的癌症［1］。我国肺癌的发生率和死亡率均排在恶性肿瘤的首位［2］。因此，明确肺癌发生发展的机制意义重大。

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是不编码蛋白质的RNA，在多种肿瘤的发生发展的调控中起着至关重要的作用［3-5］。ncRNA根据结构可分为环状RNA和线性RNA，其中线性RNA根据长度可分为微RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［6］。lncRNA是超过200个核苷酸的ncRNA，可通过组蛋白修饰、染色质重塑、与转录因子的相互作用以及DNA甲基化等方式调控基因活性［7］。大量研究［8-11］表明，lncRNA在多种肿瘤中广泛表达，其异常表达与非小细胞肺癌的增殖、迁移、侵袭等密切相关，但其作用机制尚未明确。在与肿瘤相关的lncRNA中，关于ATP6V1B1-AS1的研究尚未见报道。

本研究通过体外实验探讨ATP6V1B1-AS1在非小细胞肺癌细胞中的表达及其对于非小细胞肺癌增殖和侵袭的影响；
并利用生物信息学分析其作用机制，旨在为非小细胞肺癌的治疗提供新的靶点。

1.1 细胞来源及处理

非小细胞肺癌细胞系（A549、SK-MES-1、1299、H460）及正常人支气管上皮细胞系（16-HBE）购自中科院细胞库。10%胎牛血清（美国CLARK Bioscience公司）配置的1640培养基（以色列Biological Industries公司）、MEM培养基（美国Hyclone公司）37 ℃，5%CO2以及饱和湿度中培养。

1.2 总RNA提取及实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测

非小细胞肺癌细胞系及正常人支气管上皮细胞系总 RNA 均使用 Trizol 试剂提取。使用 Prime Script™RT reagent Kit 反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）反转录和细胞的总 RNA后，使用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂（日本TaKaRa公司）QuantStudio 1 Real-time PCR 仪用进行qRT-PCR检测。主要引物：ATP6V1B1-AS1，正向引物，5’-TCATTTTCATGAATG CTGCCTCT-3’；
反向引物，5’-CTGTGCAAGAATCAC CGTGC-3’；
GAPDH，正向引物，5’-CGGATTTGGTC GTATTGGG-3’；
反向引物，5’-CTGGAAGATGGTGA TGGGATT-3’，使用2-ΔΔCt法进行计算。

1.3 ATP6V1B1-AS1泛癌差异表达分析

从UCSC Xena数据库（https：//xenabrowser.net/）下载癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）泛癌数据集，数据集包含22种癌型，10 533个（癌9 806个；
正常727个）样本。使用文件注释后，仅保留ATP6V1B1-AS1的表达数据，使用R包“ggpubr”绘制ATP6V1B1-AS1在每个癌型中的表达情况，组间使用Wilcox计算显著性。

1.4 细胞siRNA转染及稳定表达细胞系构建

A549细胞中加入ATP6V1B1-AS1 过表达病毒悬液及病毒转染增强剂（5 μg/mL），使用抗稻瘟霉素筛选稳定转染细胞；
在SK-MES-1中加入siRNA及Lipo8000，48 h后换液用作后续实验。

1.5 CCK8实验检测细胞增殖能力

转染后细胞按照6×103/孔接种于96孔板，于0、24、48、72、96 h加入CCK8试剂37 ℃孵育2 h，然后测定450 nm波长的吸光度（optical density，OD）值，并绘制细胞增殖曲线。

1.6 细胞侵袭能力检测

1.6.1 Transwell实验：向Transwell小室上室中加入200 μL、约6×104个细胞的细胞双无悬液，下室中加入600 μL由15%胎牛血清配置的培养基。水平置于孵箱中培养 48 h，固定后制片，观察细胞侵袭数量，随机视野独立取图5次。

1.6.2 Western blotting检测相关蛋白表达：选取状态良好的过表达及敲减细胞，提取全蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后，4 ℃一抗封闭过夜，二抗封闭1 h，ECL发光显影测定E-cadherin、MMP9、Snail及GAPDH蛋白表达。

1.7 内源竞争RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络的构建

从UCSC Xena数据库下载TCGA-LUAD的miRNA数据集［log2（FPKM+1）］，包含564个（其中癌518个，正常46个）样本，使用R包对转换探针名称后的表达谱进行差异分析，设置差异表达基因的筛选阈值（|log2FC|＞0.001，P＜ 0.05），另外ATP6V1B1-AS1分别在Starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn/）、lncRNASNP2（https：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP/）数据库中预测下游miRNA，两者结果取并集，得到的miRNA与前下调的miRNA取交集。取得交集的miRNA在miRwalk（https：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRdb（https：//mirdb.org/）数据库中预测mRNA；
另外从UCSCxena数据库下载TCGA-LUAD的mRNA数据集［log2（FPKM+1）］，包含585个（其中癌526个，正常59个）样本。使用R包 “tinyarray”对数据集的ENSEMBL_ID进行转换；
使用R包“limma”对转换后的表达谱进行差异分析，设置差异mRNA的筛选阈值（|log2FC|＞1，P＜ 0.05），将筛选出的mRNA与表达上调的mRNA取交集，构建ceRNA网络并绘制火山图。

1.8 基因本体（Gene Ontology，GO）数据库及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析

将ceRNA网络中20个mRNA进行GO及KEGG功能富集分析，过滤阈值P＜ 0.05，预测ATP6V1B1-AS1可能参与调控网络的生物学功能。

2.1 ATP6V1B1-AS1在22个癌种中表达量的泛癌分析及其在非小细胞肺癌细胞系中的表达水平

结果显示，ATP6V1B1-AS1在多种癌症中高表达，并且肺鳞癌及肺腺癌中高表达，差异具有统计学意义（P＜ 0.05），见图1。Starbase数据库中ATP6V1B1-AS1在非小细胞肺癌中的表达结果显示，肺鳞癌及肺腺癌中ATP6V1B1-AS1高表达（图2），与泛癌分析中ATP6V1B1-AS1表达情况一致。qRT-PCR检测结果显示，与正常对照组比较，非小细胞肺癌细胞系A549、H460、H1299、SK-MES-1中ATP6V1B1-AS1的表达均显著增高（均P＜ 0.05），见图3。

图1 ATP6V1B1-AS1表达的泛癌分析结果Fig.1 Pancancer analysis of ATP6V1B1-AS1 expression

图2 Starbase数据库中在肺腺癌及肺鳞癌中ATP6V1B1-AS1的表达Fig.2 Expression of ATP6V1B1-AS1 in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma in the Starbase database

图3 ATP6V1B1-AS1在非小细胞肺癌细胞系（A549、H460、H1299、SK-MES-1）中的表达Fig.3 Expression of ATP6V1B1-AS1 in non-small cell lung cancer cell lines（A549，H460，H1299，SK-MES-1）

2.2 构建过表达、敲减ATP6V1B1-AS1非小细胞肺癌细胞系

根据4种非小细胞肺癌细胞中ATP6V1B1-AS1的相对表达量，使用siRNA对相对表达量最高的SKMES-1细胞进行ATP6V1B1-AS1敲减；
使用慢病毒对相对表达量最低的A549细胞进行ATP6V1B1-AS1过表达，最终分别测定两个处理组的转染效率，结果显示，A549细胞中ATP6V1B1-AS1明显过表达；
SKMES-1细胞中ATP6V1B1-AS1表达明显减少，与对照组比较，si2组、si3组si-ATP6V1B1-AS1的敲减效率差异有统计学意义（均P＜ 0.05），因此将这2种非小细胞肺癌细胞系用于后续实验。见图4。

图4 qRT-PCR检测A549细胞中过表达ATP6V1B1-AS1和 SK-MES-1细胞中敲减ATP6V1B1-AS1后ATP6V1B1-AS1相对表达水平Fig.4 The relative expression of ATP6V1B1-AS1 after transfection with over expression ATP6V1B1-AS1 in the A549 cell line and after transfection with si-ATP6V1B1-AS1 in the SK-MES-1 cell line was determined by qRT-PCR

2.3 细胞增殖能力检测

敲减及过表达ATP6V1B1-AS1细胞后测定细胞增殖能力。结果显示，敲减ATP6V1B1-AS1非小细胞肺癌细胞增殖能力减弱（P＜ 0.05），过表达ATP6V1B1-AS1非小细胞肺癌细胞增殖能力增强（P＜0.05）。见图5。

图5 敲减和过表达ATP6V1B1-AS1后非小细胞肺癌细胞的增殖能力Fig.5 The proliferation ability of non-small cell lung cancer cells after ATP6V1B1-AS1 knockdown and overexpression

2.4 细胞侵袭能力检测

过表达及敲减ATP6V1B1-AS1细胞系后选取状态良好的细胞，进行细胞侵袭能力测定；
采用Western blotting检测过表达及敲减ATP6V1B1-AS1后A549 细胞和SK-MES-1细胞侵袭相关蛋白表达水平的变化。结果显示，A549细胞过表达ATP6V1B1-AS1后侵袭能力增强，SK-MES-1细胞敲减ATP6V1B1-AS1后侵袭能力减弱。见图6。与对照组比较，过表达ATP6V1B1-AS1后A549细胞E-cadherin蛋白表达减少，Snail和MMP9蛋白表达增加（均P＜0.05）；
敲减ATP6V1B1-AS1后SK-MES-1细胞的E-cadherin蛋白表达增加，Snail和MMP9蛋白表达减少（均P＜ 0.05）。见图7。

图7 过表达、敲减ATP6V1B1-AS1后非小细胞肺癌细胞侵袭相关蛋白表达Fig.7 Invasion-related protein expression in non-small cell lung cancer cells following ATP6V1B1-AS1 overexpression and knockdown

2.5 ATP6V1B1-AS1参与的ceRNA网络构建及GO、KEGG功能富集分析

TCGA数据库中miRNA和mRNA差异表达分析结果显示，获得513个miRNA，其中差异表达上调381个，差异表达下调132个，见图8。获得 1 702个mRNA，其中差异表达上调713个，差异表达下调989个，见图9。

图9 mRNA TCGA_LUAD差异表达基因的火山图Fig.9 Volcanic figure of mRNA TCGA_LUAD differential expression gene

将ATP6V1B1-AS1在Starbase、lncRNAS-NP2数据库中预测miRNA，lncRNASNP2数据库中有107对lncRNA-miRNA关系对，Starbase数据库中有22对lncRNA-miRNA关系对，两者取并集，预测结果与396个差异miRNA取交集，得到5个miRNA，其中4个可预测到下游mRNA。将上述获得交集的miRNA在miRwalk、miRdb数据库中预测mRNA，miRdb数据库中有4 101个miRNA-mRNA关系对，miRwalk数据库中有12 250个miRNA-mRNA关系对，二者取交集，共获得936对miRNA-mRNA，将mRNA与差异表达上调的mRNA取交集，得到20个mRNA。将上述获得的4个miRNA及20个mRNA与ATP6V1B1-AS1构建lncRNAmiRNA-mRNA的关系对，绘制网络调控图，结果显示，miR-520a-5p、miR-526b-3p、miR-4524a-3p、miR-6730-5p可能作为ATP6V1B1-AS1的下游基因，并且可以调控WNT3、PAICS等基因发挥ATP6V1B1-AS1促进非小细胞肺癌增殖、侵袭的作用。见图10。

图10 ceRNA网络调控图Fig.10 ceRNA network

GO功能富集分析结果显示，ATP6V1B1-AS1下游mRNA与腺体发展等功能有关，KEGG功能富集分析显示ATP6V1B1-AS1与嘌呤代谢等功能相关。见图11、12。

图11 GO功能富集分析Fig.11 GO functional enrichment analysis

图12 KEGG功能富集分析Fig.12 KEGG functional enrichment analysis

lncRNA的异常表达在多种肿瘤中都起到了促进肿瘤发生、发展的作用［12-13］。MALAT-1、H19等多种lncRNA都与非小细胞肺癌的发生发展有密切联系。本研究中的ATP6V1B1-AS1位于 2p13.3，与编码基因ATP6V1B1的转录方向相反。已有研究［14-15］表明ATP6V1B1可以通过影响能量代谢等过程影响机体内免疫细胞的杀伤、酸碱代谢等多种生物学行为。

本研究泛癌表达分析结果显示，恶性肿瘤中ATP6V1B1-AS1可能存在异常表达，并且在肺腺癌、肺鳞癌中可能存在表达差异。qRT-PCR检测结果显示非小细胞肺癌细胞系中ATP6V1B1-AS1相对表达量高于正常人支气管上皮细胞（P＜ 0.05）。体外实验结果显示，过表达ATP6V1B1-AS1后能够促进非小细胞肺癌的增殖和侵袭。本研究通过生物信息学方法，构建了ATP6V1B1-AS1可能参与调控的ceRNA网络，预测了ATP6V1B1-AS1下游结合的miRNA-mRNA对。GO及KEGG功能富集分析结果表明，ATP6V1B1-AS1可能通过下游的ceRNA网络参与调控嘌呤代谢、腺体发展等多种生物学功能。

综上所述，ATP6V1B1-AS1在非小细胞肺癌中高表达，并且可以促进非小细胞肺癌的增殖、侵袭，通过ceRNA网络调控下游基因，从而影响相应生物学功能。本研究为明确ATP6V1B1-AS1在非小细胞肺癌诊断和治疗中的作用提供了方向。然而，本研究中尚未进行体内实验明确ATP6V1B1-AS1在体内环境中对于非小细胞肺癌增殖、侵袭的作用，并且对于下游ceRNA网络中相关基因的结合具体位点和结合方式有待进一步论证。