黄芪甲苷对小鼠2型糖尿病肾损伤的保护作用及其基于线粒体质量控制网络的作用

裴翔 刘丹 欧阳茹 黎俊森 陈铅琴 孙军萍 孙加凤 黎宗保 张丽(海南省第三人民医院内分泌科,海南 三亚 572000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病引起的一种进展性微血管并发症,是慢性肾病(CKD)和终末期肾病(ESRD)的主要病因之一〔1〕。目前DN 发生发展的分子机制尚不明确,但越来越多的证据表明线粒体内稳态紊乱可能是重要因素之一〔2～4〕。线粒体质量控制是机体为了确保线粒体功能的相对稳定,形成的以维持线粒体数目、形态及功能的特定机制,其中包括线粒体的生物合成、融合与分裂及线粒体自噬〔5〕。以上过程出现任何异常有可能影响线粒体的功能,从而导致细胞的损伤、凋亡或死亡。线粒体融合促使线粒体形成长管状网络结构,有助于受损线粒体的修复,线粒体融合蛋白(MFN)及视神经萎缩蛋白(OPA)参与调控线粒体融合。与线粒体融合相对应,线粒体分裂使其由长管网络状向短片状结构转变,促进线粒体的降解过程,动力相关蛋白(Drp)-1 与位于线粒体外膜的线粒体分裂因子(MFF)受体结合后介导线粒体的分裂。线粒体自噬是细胞及时清除损伤、衰老或过剩线粒体的机制,对正常线粒体的稳定及活动维持具有重要意义,PTEN 诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路是目前较为公认的介导线粒体自噬的途径之一,人微管相关蛋白轻链(LC)-3Ⅱ蛋白常被用作自噬形成的标志〔6〕。

黄芪甲苷(AS-Ⅳ)是羊毛脂醇型四环三萜皂苷,是黄芪的主要活性成分之一,极性较高,具有抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡等作用,并在对DN 的保护作用上得到广泛的认可〔7～9〕,但其作用机制目前尚未阐明。本研究基于线粒体质量控制过程中相关蛋白的调控研究AS-Ⅳ对DN 小鼠肾脏的保护作用及其可能机制。

1.1 实验动物 SPF 级2 型糖尿病模型C57BL/KSJ-db/db 小鼠,雄性,20 只,8 周龄;SPF 级非糖尿病性C57BL/KSJ-db/m 小鼠,雄性,10 只,8 周龄;均由南京大学模型动物研究中心提供。本实验获得动物伦理委员会批准。

1.2 药物、主要试剂和仪器 AS-Ⅳ(纯度≥98%)购于上海医药发展有限公司。应用Accu-Chek 性能血糖监测系统(Roche,德国)从小鼠尾部采集的血液样品中测定其血糖水平。过碘酸雪夫(PAS)染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。应用小鼠白蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)定量装置(Bethyl 实验室,美国) 测量24 h 尿蛋白浓度。Drp-1、MFF、OPA、MFN、PINK1、Parkin、LC-3 Ⅱ抗体购于Santa Cruz 公司。

1.3 动物模型及分组 C57BL/KSJ-db/db 小鼠20只适应性喂养1 w 后,每周监测小鼠空腹血糖及体质量,当血糖＞16.7 mmol/L,尿蛋白高于对照组,即确认DN 小鼠造模成功〔7〕。选取造模成功的小鼠,采用随机数字表法分为DN 组和AS-Ⅳ组,AS-Ⅳ组小鼠以0.2 g/kg AS-Ⅳ每日进行灌胃饲养,DN 组继续以标准饲料喂养;对照组为C57BL/KSJ-db/m 小鼠,同样以标准饲料喂养,每组6 只。

1.4 标本采集 造模12 w 后,在代谢笼中收集3组小鼠24 h 尿液,而后对小鼠进行注射麻醉,眼球取血并脱颈处死,迅速采集小鼠双侧肾脏,称重并计算肾重指数(KI),KI=双侧肾脏质量/小鼠体重×100%。称重后将左肾置于4%多聚甲醛溶液中固定,待进行病理检查;右肾置于-80℃冷冻。离心出血清后采用Roche 全自动生化仪检测血肌酐及血尿素氮,应用ELISA 检测尿液中的24 h 蛋白含量。

1.5 形态学检测 取固定后的肾脏组织在分级浓度乙醇中脱水,包埋于石蜡中,切成4 μm 厚片,应用PAS 染色以评价两组小鼠肾小球及肾小管的病理变化。由一位具有10年以上诊断经验的病理医师在双盲条件下观察每只小鼠的至少20 个肾小球和50 个近端小管(每组6 只),采用NIS-Elements Basic Research 软件定量分析小鼠肾小球系膜基质分数(系膜基质面积/肾小球面积×100%)及近端肾小管面积。

1.6 Western 印迹法检测 将冷冻的肾皮质在干冰下切成块,在含有蛋白酶抑制剂的裂解液中均浆,离心取上清,应用Bradford 蛋白测定法测量蛋白浓度。样品在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离,转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h 后,将膜与一级抗体孵育,稀释浓度为Drp-1(1 ∶1 000)、MFF(1 ∶1 000)、OPA(1 ∶1 000)、MFN(1 ∶1 000)、PINK1(1 ∶500)、Parkin(1 ∶1 000)、LC-3Ⅱ(1 ∶500),4℃过夜,而后将膜与相应的辣根过氧化物酶(HRP)耦联二级抗体孵育1 h,超敏发光液显色,凝胶成像系统检测蛋白条带,ImageJ 计算条带灰度值。

1.7 统计学分析 采用SPSS22.0 软件进行单因素方差检验、SNK-q检验、t检验、配对t检验。

2.1 3组体重、血糖及KI 的比较 3 组造模12 w后体重均显著增加,DN 组体重与对照组及AS-Ⅳ组相比显著升高(P＜0.05),AS-Ⅳ组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。对照组与AS-Ⅳ组治疗前后血糖并无明显变化(P＞0.05),而DN 组血糖显著升高,且明显高于对照组及AS-Ⅳ组(P＜0.05)。DN 组KI 与对照组相比显著升高(P＜0.05),与AS-Ⅳ组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 3 组体重、血糖及肾重指数、肾功能指标的比较(±s,n=6)

表1 3 组体重、血糖及肾重指数、肾功能指标的比较(±s,n=6)

与对照组比较:1)P＜0.05;与DN 组比较:2)P＜0.05;与治疗前比较:3)P＜0.05;下表同

组别体重(g)血糖(mmol/L)治疗前治疗后治疗前治疗后KI(%)血肌酐(μmol/L)血尿素氮(mmol/L)24 h 尿蛋白(mg/L)对照组25.5±0.1333.92±1.643)6.13±0.576.17±0.4911.07±0.6613.79±0.911 4.13±2.5111.03±0.74 DN 组28.9±0.97 40.53±1.471)3) 19.37±1.90 28.50±1.841)3) 23.75±3.581) 16.33±2.581) 19.28±3.021) 40.53±2.391)AS-Ⅳ组28.2±1.10 34.20±2.332)3) 20.00±1.4417.59±2.032)19.13±1.8914.02±1.202) 15.59±2.972) 29.01±2.222)

2.2 3组肾功能指标的比较 DN 组与对照组相比较,血肌酐、血尿素氮及24 h 尿蛋白均显著升高(P＜0.05),而AS-Ⅳ组相较于DN 组均显著降低(P＜0.05)。见表1。

2.3 3组肾脏组织形态学比较 对照组肾小球及肾小管结构基本正常,DN 组肾小球细胞肥大,系膜扩张,肾小球及肾小管系膜基质明显增厚,胞质内糖原增多(箭头所示)。见图1。与DN 组相比较,AS-Ⅳ组肥大的肾小球得到显著改善,肾小球系膜基质分数及近端肾小管面积均下降,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

图1 3 组肾脏组织PAS 染色(×400)

表2 3 组肾小球系膜基质分数、近端肾小管面积比较(±s,n=6)

表2 3 组肾小球系膜基质分数、近端肾小管面积比较(±s,n=6)

组别肾小球系膜基质分数(%)近端肾小管面积(μm2)8.23±1.41 126±129 DN 组13.25±2.11)1 278±1461)AS-Ⅳ组9.87±1.82)1 089±852)对照组

2.4 3组肾脏组织中线粒体质量控制相关蛋白表达水平的比较 与对照组相比较,DN 组肾脏组织中OPA、Mfn、PINK1、Parkin、LC-3 Ⅱ蛋白表达量降低,Drp-1、MFF 蛋白表达量升高,其中Drp-1、OPA、PINK1、LC-3Ⅱ蛋白表达量差异具有统计学意义(P＜0.05);与DN 组相比,AS-Ⅳ组肾脏组织中Drp-1、MFF、Mfn 蛋白表达量降低,OPA、PINK1、Parkin、LC-3Ⅱ蛋白表达量升高,其中Drp-1 及LC-3 Ⅱ蛋白表达量差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图2、表3。

图2 3 组肾脏组织线粒体质量控制相关蛋白表达

表3 3 组肾脏组织线粒体质量控制相关蛋白表达的比较(±s,n=6)

表3 3 组肾脏组织线粒体质量控制相关蛋白表达的比较(±s,n=6)

组别Drp-1MFFOPAMfnPINK1ParkinLC-3Ⅱ8±0.341.02±0.141.23±0.14 DN 组2.33±0.21)1.24±0.251.37±0.151)2.12±0.30.81±0.171)0.95±0.150.65±0.31)AS-Ⅳ组0.91±0.32)1.17±0.291.46±0.382.07±0.411.02±0.31.03±0.180.94±0.22)对照组0.83±0.210.98±0.172.55±0.142.44±0.151.6

AS-Ⅳ对DN 引起的肾脏损伤具有一定的保护作用已被证实〔10〕,本研究验证了AS-Ⅳ对于由2 型糖尿病引发的DN 损伤具有一定的保护及治疗作用;PAS 染色结果也证实在经过AS-Ⅳ治疗后的小鼠肾脏组织,肾小球及肾小管病理变化程度均较DN 组有所缓解。

有研究表明,当肾脏细胞线粒体损伤时,线粒体进行过度分裂并发生去极化,导致其失去功能〔11〕。本研究结果提示,AS-Ⅳ对糖尿病肾脏细胞的保护作用可能与抑制线粒体的过度分裂有关。高糖会导致肾小管细胞自噬功能的下降及自噬体清除能力的减低,这与DN 的发病机制可能有密切的关系〔12,13〕。在CKD 中,线粒体自噬水平以降低为主,而自噬水平的升高对多种肾脏疾病具有保护作用〔14〕,PINK1/Parkin 信号通路是介导线粒体自噬的主要途径,当线粒体受损时,PINK1 堆积在线粒体外膜同时磷酸化泛素及E3 泛素连接酶Parkin,Parkin 通过联合LC3Ⅱ,将泛素化线粒体传递入自噬小体,形成线粒体自噬〔15〕。LC3Ⅱ是自噬体形成的关键蛋白,是评价自噬水平的指标,自噬增强可导致LC3Ⅱ上调。本研究结果表明,线粒体自噬水平升高,起到保护肾脏细胞受损的作用,PINK1 及Parkin 蛋白表达亦均有上升趋势,提示AS-Ⅳ有可能通过增强PINK1/Parkin 信号通路,从而介导更多自噬小体的形成,除此之外,是否还有其他介导自噬的途径参与其中,则需进一步研究证实。