miRNA和甲基化酶抑制剂在支气管哮喘中对Th细胞的影响

张茹 卜倩 贾宏林 梁晓鹰 高丽 姜孝芳

支气管哮喘(bronchial asthma, BA)是以发作性喘息伴呼吸困难为主要症状[1]且与微小RNA(microRNA, miRNA)有关[2]的疾病。miRNA可下调靶向转录的蛋白质来调控病理生理改变[3]，并可调控BA的发展[4]。DNA甲基化是不改变DNA序列而调控基因产生可遗传性改变[5-6]。在哮喘中发现DNA甲基化的变异，这将推进阐明BA在表观遗传学中的机制[7]。本研究旨在探究BA中miR-126、miR-326和miR-155的表达以及甲基化酶抑制剂对BA的调控作用。

一、主要实验材料与试剂

5-氮杂胞苷(A2385，Sigma)，TRIzol裂解液(152104，Invitrogen)，HISTOPAQUE®-1077 (RNBF2219，Sigma)，磁珠抗体(557787，BD)，兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6001，中杉金桥)，IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3抗体(A2385、AF6233、DF3196、AF6544)均定购于Affinity，miScript Ⅱ RT Kit(218161)、miScript SYBR Green PCR kit(1046470)、miScript miRNA-126 Primer Assay(MS00003430)、Hs-miR-326 miScript Primer Assay (MS00003948)、Rn-miR-326 miScript Primer Assay (MS00027342)Hs-miR-155 miScript Primer Assay (MS00008778)、Hs-RNU6 miScript primer assay(MS00033740)均定购于QIAGEN，实验所需引物序列见表1。

表1 引物序列信息表

二、研究对象

1 哮喘患者

病例为自2015年10月到2017年12月就诊于新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院及新疆医科大学附属中医医院的哮喘急性发作期患者(48例)，并符合2016年发布的《支气管哮喘防治指南(2016年版)》[8]里的诊断要点，排除严重的循环系统、内分泌系统疾病、系统性疾病及妊娠，排除采血一周内服用抗组胺药物、免疫抑制剂等。对照组在新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院及新疆医科大学附属中医医院的健康志愿者(48例)中选择。对照组排除近期有感染史、哮喘、类风湿性关节炎及其他免疫性疾病患者，排除前一个月内服用过三环类抗抑郁药、β受体阻滞剂或抗组胺药等的患者以及有亲属患有过敏性疾病和哮喘病史的人群。本研究获新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院及新疆医科大学附属中医医院伦理委员会批准(20120220-144)，患者或近亲亲属对研究方案签署知情同意书。

2 动物模型

于新疆医科大学动物实验中心选购180～240 g的无病原体SPF级SD雄性大鼠，并清洁饲养。随机将大鼠分为4组，每组10只，分组为：正常组、哮喘模型(BA)组、5-aza低剂量(5-aza-L)组、5-aza高剂量(5-aza-H)组。

三、研究方法

1 临床标本的采集及CD4+T细胞的分离

在无菌条件下对病例组和对照组取静脉血5mL，使用HISTOPAQUE®-1077分离淋巴细胞。将分离的淋巴细胞用500 μL磷酸缓冲盐水培养液处理，与45 μL磁珠抗体混合，得到CD4+T细胞。CD4+T细胞保存在-80℃备存，用于后续实验。

2 动物造模

动物致敏：动物实验的第1、7、14天对大鼠进行基础致敏，除正常对照组外其他组在实验的第1天使用10%的OVA溶液(10%的Al(OH)3为佐剂)1 mL腹腔注射进行基础致敏，第7天和第14天再次腹腔注射1 mL上述溶液，正常对照组用生理盐水代替致敏溶液进行注射，部位、剂量及方法与其他实验组相同。

动物激发：第一天致敏在腹腔内注射10 %OVA和Al(OH)3混合液1 mL，待第7日重复1次以加强致敏，第14天基础致敏后将大鼠置入自制透明雾化吸入箱激发，按3 %的浓度OVA雾化吸入(雾粒直径3～5 μm)，每日1次，每次30 min，连续15日。正常组予等量生理盐水腹腔注射以及雾化吸入，其余方法同哮喘模型组。激发过程中大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、点头呼吸、短气喘息、二便失禁及站立不稳等表现为激发成功。

动物给药：第31日起药物干预，腹腔注射5-aza-L(0.5 mg/kg)和5-aza-H(5 mg/kg)，连续给药7天，每次给药前30min进行OVA雾化30min。

3 CD4+T细胞和大鼠模型RNA的提取

分离出的T细胞，采用TRIzol法提取总RNA后逆转录，用于RT-PCR检测。按照试剂盒说明手册进行操作，用Nanodrop 2000测定RNA的浓度。取各组大鼠右肺约50 mg，放入液氮中研磨组织，与T细胞提取总RNA相同。

4 实时荧光定量RT-PCR检测miRNA 以及Th细胞相关因子mRNA的表达

按照逆转录试剂盒说明书操作，将RNA置于MyCyclerTM Thermal Cycler 中进行逆转录，逆转录反应条件为：37 ℃，15 min；
85 ℃，5 s；
4 ℃，+∞；
得到cDNA，然后于PCR仪器中进行扩增，反应体系：2× Master Mix 10 μL、10× PCR Universal Primer 2 μL、10×PCR Primer Assay 2 μL、cDNA 模板2 μL、灭菌水补充至20 μL。扩增反应程序：95 ℃, 15 min;94 ℃, 15 s;55 ℃, 30 s;70 ℃, 34 s；
循环数：40。最后用2-△△Ct法计算各组mRNA相对表达量。

5 HE染色及免疫组化检测大鼠肺组织中蛋白表达

造模结束后取大鼠肺组织，进行包埋、切片，HE染色，一抗孵育过夜、显色、二抗孵育、复染封片。在光镜下观察肺组织气道的变化，每组选取6个样本，每个样本选取5个不重叠视野，测定平均吸光度用软件Image-Pro Plus进行分析。

四、统计学方法

一、哮喘组与正常组中miR-126、miR-326和miR-155 mRNA的相对表达量

miR-126 、miR-326和miR-155在哮喘组表达水平高于正常组，差异有统计学意义。(表2)

表2 哮喘患者组与正常组miR-126、miR-326、miR-155的表达水平

二、哮喘组与正常组中IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA的相对表达量

IFN-γ和 Foxp3在哮喘组表达水平明显低于正常组，差异有统计学意义；
ROR-γ在哮喘组表达水平显著高于正常组，差异有显著统计学意义。(表3)

表3 哮喘患者组与正常组IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3的表达水平

三、 哮喘患者miR-126、miR-326和miR-155 mRNA与IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA的相关性分析

Pearson相关性分析显示在哮喘患者中miR-126 、miR-326和 miR-155 与IFN-γ、GATA3 、ROR-γ和Foxp3表达无明显相关性(见表4)。

表4 哮喘患者miR-126、miR-326和miR-155 mRNA与IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA的相关性分析

四、各组大鼠肺组织病理学变化

光镜下观察显示: 正常组支气管平滑肌细胞、黏膜皱襞无增生，无炎性渗出物，杯状细胞无增生，气道内无明显炎性细胞; 哮喘组气管壁周围有大量炎性细胞浸润，部分肺泡壁断裂，杯状细胞出现增生，支气管黏膜皱襞增多延长，管腔缩窄；

5-aza-L组、5-aza-H组周围有少量炎性细胞浸润，支气管黏膜皱襞少许增多，杯状细胞少量增生，管腔有些轻微缩窄。(图1)

图1 HE染色观察大鼠肺组织病理改变(×200)

五、5-aza干预大鼠模型对miR-126、miR-326和miR-155 mRNA表达的影

miR-126在哮喘组表达水平高于正常组，在5-aza-L组和5-aza-H组表达水平低于哮喘组，差异有统计学意义；
miR-326在5-aza-L组表达水平低于哮喘组，差异有显著统计学意义；

miR-155在5-aza-L组表达水平低于哮喘组，差异有统计学意义。(表5-6)

表5 大鼠正常组与哮喘组miR-126、miR-326、miR-155的表达水平

表6 大鼠模型各组miR-126、miR-326、miR-155的表达水平

六、5-aza干预大鼠模型对IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 mRNA 表达的影响

IFN-γ在5-aza-H组表达水平低于哮喘组，差异有显著统计学意义；

GATA3在哮喘组表达水平明显高于正常组，在5-aza-H组表达水平低于哮喘组，差异有统计学意义；
ROR-γ在哮喘组表达水平明显高于正常组，在5-aza-L组和5-aza-H组表达水平明显低于哮喘组，差异有显著统计学意义；
Foxp3在哮喘中表达低于正常组，在5-aza-L组表达水平明显高于哮喘组，差异有显著统计学意义。(表7-8)

表7 大鼠正常组和哮喘组IFN-γ、GATA3 、ROR-γ、Foxp3的表达水平

七、5-aza干预大鼠模型对IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3 蛋白 表达的影响

免疫组化检测，计算平均光密度进行相对表达分析，IFN-γ在哮喘组的表达水平低于正常组，在5-aza-L组表达水平高于哮喘组，差异有显著统计学意义；
GATA3在哮喘组的表达水平高于正常组，5-aza-L组和5-aza-H组表达水平低于哮喘组，差异有显著统计学意义；

ROR-γ在哮喘组表达水平明显高于正常组，5-aza-L组和5-aza-H组表达水平低于哮喘组，差异有显著统计学意义；
Foxp3在哮喘组表达水平明显低于正常组，5-aza-L组和5-aza-H组表达水平高于哮喘组，差异有显著统计学意义。(图2，表9-10)

表9 大鼠正常组和模型组中IFN-γ、GATA3 、ROR-γ、Foxp3蛋白的平均吸光度值

图2 大鼠模型各组IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3的蛋白表达水平(×400)

表8 大鼠模型各组IFN-γ、GATA3 、ROR-γ、Foxp3的表达水平

CD4+T可分为Th1、Th2、Th17以及Treg四个亚群，Th1细胞分泌干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)，参与细胞免疫和迟发性超敏炎症反应[9]；

Th2细胞的转录因子GATA结合蛋白3 ( GATA binding protein 3, GATA3)具有促炎作用[10-11]。Treg细胞负责维持自身耐受并抑制自身免疫, 而Th17细胞参与炎症反应[12]。Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡在哮喘发病中起重要作用[13]，免疫失衡易引起气道炎症疾病，以BA最常见[14]。哮喘发作时，GATA3表达迅速升高，促进气道高反应性和气道壁重塑[15]。本研究结果表明，与正常组相比较，IFN-γ和叉头翼状螺旋转录因子3(winged-helix transcription factor 3, Foxp3)在人体外周血中哮喘组表达水平明显降低，而哮喘组维甲酸相关孤儿受体(retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,ROR-γ)表达水平明显升高，与此前研究一致。本研究大鼠模型中， GATA3和ROR-γ在哮喘组表达水平升高，这与此前研究一致。

表10 大鼠模型各组中IFN-γ、GATA3、ROR-γ、Foxp3蛋白的平均吸光度值

近年来，研究发现BA发病与miRNA有关[16]，可能通过影响炎症因子释放参与BA的病理改变[17]。miRNA是CD4+T细胞分化的重要调节因子[18]，有研究发现调节miR-126[19]和miR-155[20]可以调节Th细胞因子平衡[21]。因此，miRNA与Th细胞因子在BA中的作用成为哮喘新的研究方向。miR-126定位于9号染色体类表皮生长因子样结构域7基因7号内含子中，能调控Th2细胞因子表达[22]，参与机体炎症反应及免疫应答[23]， miR-126 表达降低可调控GATA-3表达进而使Th2 细胞减少释放炎性介质，改善气道炎症反应[24]，缓解哮喘小鼠气道炎症反应[25]。本研究结果表明， miR-126在哮喘患者组表达水平升高，在大鼠模型中，miR-126在哮喘组表达水平升高，ROR-γ表达水平升高，与此前研究一致。从本研究结果来看，在大鼠模型中，哮喘组miR-126表达水平升高，GATA3和ROR-γ表达水平升高，推测miR-126与GATA3和ROR-γ可能存在负调控关系。miR-326位于人体11号染色体，之前研究发现miR-326在变应性鼻炎CD4+T淋巴中高表达且与低表达的IFN-γ负相关，推测miR-326可能影响Th1细胞因子IFN-γ的表达[26]，miR-326先前也已被证明通过诱导 Th17 分化和成熟在免疫发病机制中发挥作用[27]且miR-326在哮喘中调控气道平滑肌细胞[28]从而参与哮喘的发生发展。本研究结果表明，哮喘患者组miR-326表达水平升高，与此前研究一致，哮喘患者组同时ROR-γ表达水平升高，IFN-γ和Foxp3表达水平降低。进行大鼠造模，结果显示，在大鼠哮喘组中GATA3和 ROR-γ表达水平升高，与此前研究一致。miR-155位于人体21号染色体上， 具有维持人类免疫系统功能[29]。有研究发现，BA患者血清miR-155水平显著增加[30], 且与其肺功能呈显著负相关性，而且miR-155能够抑制CD4+T细胞中IFN-γ信号转导[31]，促进miR-155的表达，IFN-γ表达水平明显降低而GATA3表达水平升高[32]，推测miR-155可以负调控IFN-γ和正调控GATA3的表达。在本实验中，哮喘患者组miR-155表达水平升高，ROR-γ表达水平升高，IFN-γ和Foxp3表达水平降低，与此前研究一致，本研究在哮喘患者组和正常组中miR-126、miR-326和miR-155与IFN-γ、GATA3、 ROR-γ和Foxp3呈弱相关性，考虑原因有三，一可能与病人过敏源不同有关，二可能与疾病发展阶段有关，三可能与哮喘复杂机制有关，因其多种基因多种通路调控，所以此后应针对以上原因细化研究方案，探究它们具体调控关系。

DNA甲基化可以通过调控Th细胞因子失衡进而调控炎症因子的基因表达[33]，比如DNA甲基化通过调控Th细胞因子失衡参与了类风湿炎早期炎症的发生发展[34]。5-aza作为一种甲基化酶抑制剂，它被证明可以通过调节甲基化来调节miRNA的转录[35]及下调Th2表达抑制炎症反应，减轻鼻黏膜损伤，缓解AR大鼠过敏性症状[36]，例如之前发现miR-126在甲基化酶抑制剂作用下表达降低[37]。本研究用5-aza干预大鼠后显示大鼠模型中5-aza低剂量组miR-126、miR-326和miR-155表达水平降低，所以5-aza作为甲基化酶抑制剂还可以调控miR-126、miR-326和miR-155的表达水平，且调控作用与5-aza剂量正相关。此外，免疫组化结果显示，与哮喘组相比，IFN-γ蛋白表达水平在5-aza低剂量组表达升高而5-aza高剂量组中并未升高，这表明5-aza对IFN-γ的调控作用是双向的；
GATA3和ROR-γ表达水平在哮喘组表达升高在5-aza 干预之后下降；
Foxp3表达水平在5-aza 干预之后升高，因此，5-aza作为甲基化酶抑制剂可以调控IFN-γ、GATA3、ROR-γ和Foxp3基因甲基化的表达。

综上所述，在哮喘中，甲基化酶抑制剂5-aza可以调控miR-126、miR-326和miR-155的表达；
甲基化酶抑制剂5-aza可以下调细胞因子GATA3、ROR-γ的表达以及上调Foxp3的表达，同时可通过调整5-aza的剂量双向调节IFN-γ的表达。

miR-326与 GATA3和 ROR-γ表达呈正相关；

miR-326和 miR-155 与 Foxp3表达呈负相关，所以 miR-326、miR-155以及Th细胞因子可能存在交互关系，为表观遗传药物治疗哮喘提供了新的思路，miRNA和甲基化酶抑制剂可以作为BA和气道敏感反应的有效切入点，为哮喘中表观遗传药物的研究开阔了思路。