红谷黄酒发酵过程中微生物多样性与理化指标、挥发性风味的相关性分析

谷晓东，李素萍，杨柳青，刘怡琳，马艳莉,,*，陈志周,3,*，王印壮，刘 旭

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；
2.南阳理工学院张仲景国医国药学院，河南 南阳 473004；
3.河北农业大学机电工程学院，河北 保定 071001）

黄酒是我国传统的发酵酒精饮品之一[1]，其历史悠久，与啤酒、葡萄酒并称为世界三大古酒[2-3]。因其营养丰富，富含氨基酸、有机酸、多种维生素、活性多肽、功能性低聚糖及微量元素[4-7]，素有“酒中之祖、液体蛋糕”美誉；
具有降血压、抗氧化、提高免疫力、降胆固醇和抗衰老等生理功效[8-10]。黄酒通常是以富含淀粉的糯米、小米、高粱等谷物为原料[11]，曲药作为糖化发酵剂，经过浸米、蒸米、摊凉、落缸、拌曲、发酵、压榨、澄清、过滤、杀菌等多道工艺[12]酿造而成。

具有养生及保健作用的小米黄酒已成为研究热点之一，如石黎琳等[13]利用顶空固相微萃取技术，结合气相色谱-质谱联用检测技术研究了不同品种小米对黄酒风味的影响。红酒谷（Panicum miliaceumL.）是河南省南阳盆地的特色农作物，外壳呈红色，脱壳后得到的小米也称红小米。其性温，是药食两用食材，具有清热止渴、滋阴补肾、健脾暖胃之功效[14]。其富含多种营养物质、比例协调，常被用于酿造南阳黄酒，使得南阳黄酒具有独特的风味[15]。南阳更因此入围“世界美酒特色产区[16]”。极大促进了黄酒生产原料红谷产业的发展，成为当地农民增收的新路径，广泛获得当地政府和扶贫部门认可[15,17]。红谷的发展大有前景。

微生物对于发酵过程中风味物质的产生有很大的影响，多样的微生物结构使发酵食品经过复杂的微生物代谢作用产生了多样性的风味变化。洪家丽等[18]通过红曲黄酒研究发现乳球菌属、酿酒酵母和假单胞菌属等与酿造过程中的挥发性风味物质大多呈正相关。陈蒙恩等[19]研究陶融型大曲发现芽孢杆菌属和乳杆菌属与吡嗪类、酯类和芳香族类等多数挥发性风味成分呈显著正相关，魏斯氏菌属与吡嗪类、酮类、酸类和酯类均呈显著正相关。严超[20]经研究发现多种细菌可以与同一风味物质具有相关性，某种微生物也能够与多种风味物质具有相关性；
乳酸杆菌属和乳球菌属等与脂肪酸类以及酯类物质具有很强的相关性；
伯克氏菌属与高级醇具有较强的相关性，芽孢杆菌与氨基酸具有较强的相关性，肠杆菌属和乳酸杆菌属等与有机酸具有较强的相关性。食品中风味物质的形成如酸、酯、醇、有机酸等都与微生物的作用相关。

Li 等[21]通过比较红谷与其他5 种酿造原料在预处理过程中的理化和结构特性发现红谷含有较高的蛋白质，浸泡后浸泡水酸度高、回生值低和预处理后具有较大的孔状结构，对于进一步的酿造可能有益。红谷具有较高的营养价值且适用于酿造的特点，可作为黄酒新的酿酒原料，目前这一新原料还未被深入开发。本研究以红谷黄酒酒醪为对象，通过高通量测序技术分析不同发酵时间的酒醪中微生物群落结构及其与风味的相关性。旨在更好地了解研究红谷黄酒发酵机理，为红谷黄酒品质的提升与发展提供理论参考。

1.1 材料与仪器

红谷 河南南阳当地超市；
小米红曲 河南南阳润之酒业；
甲醛 洛阳市化学试剂厂；
氢氧化钠天津市风船化学试剂科技有限公司；
葡萄糖、苯酚天津市科密欧化学试剂有限公司；
3，5-二硝基水杨酸天津市光复精细化工研究所；
酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠 天津市光复科技发展有限公司；
盐酸 洛阳昊华化学试剂有限公司；
以上所用试剂均为分析纯；
3-辛醇标准品（纯度≥98%） 上海麦克林试剂有限公司；
PowerSoil®DNA Isolation Kit 试剂提取盒深圳市安必胜科技有限公司；
KOD FX Neo 聚合酶（活力1 U/μL）、KOD FX Neo 缓冲液 东洋纺（上海）生物科技有限公司；
脱氧核苷三磷酸（dNTP） 上海源叶生物科技有限公司；
ddH2O 上海谱振生物科技有限公司；
OMEGA DNA 纯化柱 广州飞扬生物工程有限公司 。

5424R 高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；
PAL-α糖度计 日本爱拓公司；
ME204E 电子分析天平 梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；
PHS-3C pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；
101 型电热鼓风干燥箱 北京市永光明医疗仪器厂；
725N 紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；
DZKW-4 电热恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；
ZNCL-BS 磁力搅拌器 上海卓越仪器设备有限公司；
50/30 μm DVB/CAR/PDMS 顶空固相微萃取纤维头 美国Supelco 公司；
7890B-5975C 气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent 仪器有限公司；
NanoDrop 2000 超微量分光光度计 上海在途生物科技有限公司；
Illumina Novaseq6000 PE250高通量测序平台 北京擎科生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红谷黄酒的发酵 以红谷为原料（以干米质量2 倍的纯净水浸泡24 h），小米红曲为酒曲，料液比（干红谷:酒曲:水）为1:0.16:0.5（g/g/g）将蒸熟晾凉后的红谷、酒曲、水混合均匀，落料品温控制在24～28 ℃；
前发酵维持7 d，发酵温度为28～32 ℃；
后发酵时间为23 d，控制温度25～26 ℃，酿造红谷黄酒并于发酵过程中取样10 次，分别为第1～7、10、20和30 d，每个样品做三个平行。

1.2.2 理化指标测定 样品先7500 r/min 离心10 min，取上清液测定。

1.2.2.1 总糖、还原糖的测定 3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定[22]。

a.葡萄糖标准液配制：称取大于1 g 的葡萄糖置于热风干燥箱98 ℃干燥至恒重，准确称取1.000 g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。分别取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于25 mL 具塞试管中补蒸馏水至1.5 mL，加入1.5 mL DNS 试剂充分混匀后沸水浴5 min，流水冷却后定容至25 mL 混匀，放置20 min 后以蒸馏水为空白对照在540 nm 波长下测定吸光度，绘制吸光度-葡萄糖浓度曲线的回归方程。回归方程为：y=0.4811x-0.0295（R2=0.9979）。

b.酒样检测：吸取试样2～10 mL（控制水解液总糖含量为1～2 g/L）于500 mL 容量瓶中，加水50 mL和盐酸溶液（6 mol/L）5 mL，在68～70 ℃水浴中加热15 min。冷却后加入甲基红指示液2 滴，用氢氧化钠溶液中和至红色消失（近似于中性）。加水定容，摇匀，用滤纸过滤后备用；
测定时，以试样水解液代替葡萄糖标准溶液，以蒸馏水为空白对照在540 nm 波长下测定吸光度带入回归方程得总糖含量。

1.2.2.2 其他理化指标的测定 酒精度、总酸、pH、氨基态氮：按照GB/T 13662-2018《黄酒》测定。可溶性固形物：糖度仪测定。

1.2.3 挥发性风味物质的测定 样品前处理：使用SPME 设备和50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）涂覆的纤维。将NaCl（1.0 g）和25.0 μL 3-辛醇添加到20 mL顶空瓶中的样品（7.5 mL）中。将样品在50 ℃下萃取15 min；
然后，将纤维插入GC（250 ℃）的进样口中7 min 以解吸分析物。用于气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）测定[23]。

GC 的柱温箱温度最初以50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 至80 ℃（保持2 min），以5 ℃/min 至230 ℃（保持10 min），10 ℃/min 至250 ℃（保持5 min）。载气：氦气（＞99.999%），流速为1 mL/min，分流比5:1。

MS 条件：在70 eV 电压下产生了在电子碰撞（EI）模式下运行的质量检测器，离子源温度为230 ℃。使用全扫描（Scan）；
扫描范围29～350 amu。通过比较质谱库搜索（NIST 14.0 和Wiley 6.0）和真实标准的保留时间来量化挥发性化合物。对匹配度80%以上的组分进行半定量分析，并将浓度表示为插入内标物（3-辛醇）的当量。

1.2.4 DNA 的提取和PCR 扩增 采用PowerSoil®DNA Isolation Kit 试剂盒提取酒醪微生物宏基因组总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取结果，用NanoDrop 2000 超微量分光光度计检测DNA提取浓度和纯度。以提取的DNA 为模板，根据引物338F （5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3"）和806R（5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3"）对细菌16S rDNA 的V3-V4 区扩增。根据引物ITS1F （5"-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3"）和ITS2 （5"-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3"）对真菌ITS1 区域的扩増。

DNA 模板50 ng，正反向引物各0.9 μL，KOD FX Neo 聚合酶0.6 μL，KOD FX Neo 缓冲液15 μL，脱氧核苷三磷酸（dNTP） 6 μL，加入ddH2O 定容至30 μL。PCR 扩增程序：98 ℃预变性2 min；
98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 个循环；
72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[24]。

1.2.5 高通量测序 PCR 产物通过1.8%琼脂糖凝胶回收，利用OMEGA DNA 纯化柱进行纯化，用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，文库构建和测序由北京擎科生物科技有限公司Illumina Novaseq6000 PE250平台来完成。以上DNA 的提取、PCR 扩增及高通量测序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 数据处理

实验数据使用Origin Pro 8.6 统计程序分析，显著性分析使用SPSS v.22.0 软件。将Illumina Novaseq 6000 PE250 测序平台生成的原始数据使用QIIME平台进行生物学信息分析，具体如下：测序得到的数据首先将成对的reads 拼成一条序列，使用 Usearch v10 软件对拼接效果进行质量控制和过滤；
然后使用cutadapt 1.9.1 软件根据引物序列和序列首末两端的条形码（barcode）进行区分样品；
使用 UCHIME v4.2 软件，鉴定并去除嵌合体序列并得到有效序列；
使用Usearch 软件对前述得到的优化序列按97%的相似度进行操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs）划分。以SILVA 和NCBI 为参考数据库，利用QIIME 软件生成不同分类水平上的物种丰度表以及使用MEGAN 软件将测序得到的物种丰度信息回归至数据库的分类学系统关系树中。使用QIIME 平台自带程序分别计算黄酒样品真菌和细菌的α与β多样性（β多样性采用 binary jaccard、bray curtis、weighted unifrac（限细菌）、unweighted unifrac（限细菌）等4 种算法计算）。微生物检测所得数据的处理计算均由北京擎科生物科技有限公司完成。

2.1 发酵过程中理化指标变化

经检测红谷黄酒最终总糖含量为9.18 g/L，根据GB/T 13662-2018《黄酒》标准，为非稻米干型黄酒。由表1 可知，还原糖含量先急剧减少后逐渐稳定。发酵1 d 酒中还原糖含量较高可能是因为酒曲中存在的α-淀粉酶和γ-淀粉酶共同作用于淀粉，将原料内的淀粉分解后产生大量还原糖。发酵1～7 d，从49.37 g/L 降低至12.36 g/L，可能由于发酵剂分泌的淀粉酶附着于谷物原料，将淀粉等生物大分子分解成的糖类转化成谷氨酸、乙醇等小分子物质，用于后期风味形成[25]。发酵后期含量变化较平缓在5.93 g/L左右，酒醪中只存在少量葡萄糖、糊精、低聚糖。

表1 发酵过程中红谷黄酒理化指标Table 1 Physiochemical indexes of red millet Huangjiu during fermentation

酒精度变化趋势与还原糖相反，前酵（1～7 d）酒精度从1.30%vol 快速上升至14.73%vol。后酵（第8～30 d）发酵温度降低，酒精度增长缓慢；
20 d 达到最高值（15.55%vol），30 d 酒精度有所下降（14.63%vol）。后酵阶段酒精度较高可能会反过来抑制酵母菌的代谢活动，导致还原糖的分解转化效率降低，导致黄酒糖分积累；
乙醇也可与酸类物质进行酯化反应生成酯类成分[26]。

总酸含量先快速增加（1～4 d）后减少（5～7 d）再增加（10～30 d）。发酵初始酒中总酸含量为3.54 g/L，可能是前期谷物浸泡的米浆水中酸类物质通过蒸米饭带入发酵醪中，从而创造适合发酵醪中酵母菌生长的发酵环境，抑制杂菌的生长[27]。发酵后期总酸增加，可能是产酸菌株在后期酿造中也比较活跃[28]。红谷在发酵过程中易吸水溶胀，使自溶产物增加（氨基酸、有机酸），而有机酸作为乳酸菌代谢主要产物，发酵醪酸值与乳酸杆菌数量成正相关[29]。pH 在发酵过程中未见显著变化（P＞0.05），发酵结束时pH＜4（3.66）。较低的pH 为有益优势菌群的快速繁殖、生长提供适宜的环境，保证发酵顺利完成[30]。

氨基态氮先波动增加（0～7 d）后急剧上升（10～30 d）。由于前酵时间较短，酒中蛋白质初级水解，氨基态氮生成量少，稳定在0.26～0.59 g/L。发酵后期原料中蛋白质在酒曲微生物分泌的肽酶、蛋白酶作用下逐步水解成氨基酸等营养物质，从而导致氨基态氮富集[31]。除了原料（米和酒曲）中蛋白质能释放氨基态氮，酵母酿造后期自溶也会增加氨基态氮含量[31]。

可溶性固形先剧烈下降（1～3 d）后趋于稳定（4～30 d）。发酵1 d 样品可溶性固形物大部分来自于酒曲中曲霉、根霉等微生物代谢产物。可溶性固形物含量随时间增加而迅速降低，在4 d 降至最低10.36%。这是因为糖类等营养物质被酒曲中的微生物大量消耗转化为乙醇、二氧化碳等非可溶性固形物，可溶性固性物含量呈下降趋势[32]。随着发酵的进行固形物含量增加，发酵30 d 含量略有回升为12.25%，可能是发酵后期微量元素、水溶性蛋白等有机物的积累所致。

2.2 发酵过程中挥发性风味物质变化

由表2 可知，发酵阶段检测出7 种醇、9 种酯、2 种酸和1 种醛共19 种挥发性风味物质。这些物质在酒中的含量不同形成了黄酒不同的香气特征[33]。醛类、酮类、酯类、醇类等非烃类化合物是黄酒香气的主要来源[34]。由表2 可知，黄酒中醇和酯类含量较多，种类丰富，发酵结束时含量分别为687718.51 μg/L和70684.11 μg/L，乙醇是黄酒中主要的成分。苯乙醇具有玫瑰香、甜香香气，可以贡献愉悦、柔和、协调的黄酒香气[35]，其含量在第30 d 为768.82 μg/L。2-丁醇、异丁醇、异戊醇和2,3-丁二醇是黄酒中的重要醇。醇类物质由谷物蛋白分解得到的氨基酸分解代谢形成，是陈化酯类成分的前体物质。

表2 红谷黄酒发酵过程中的挥发性风味物质含量Table 2 Contents of volatile flavor compounds in the fermentation process of red millet Huangjiu

酯类的花香、水果香气对黄酒的风味有很大的影响。其中，乙酸乙酯含量最高，从390.71 μg/L（发酵1 d）增长到52828.30 μg/L（发酵30 d）。酯类物质在后酵后期（20～30 d）快速积累，说明后发酵阶段是一些酯类（乳酸乙酯、己酸乙酯）形成的关键时期，酯类风味可以通过氨基酸、有机酸及其他物质的转化产生。发酵30 d 的黄酒样品中的乙醛含量较高为6572.29 μg/L，在发酵前期呈波动上升趋势，后酵期间显著下降（P＜0.05）。这说明在发酵后期乙醛在酒醪微生物的作用下存在一定降解。

研究发现，谷物发酵能增加黄酒中的的非烃类挥发性化合物，如酸类化合物[31]。酸类物质特别是有机酸（如琥珀酸、乳酸等）对黄酒良好风味的形成具有重要影响[26]。红谷黄酒产生了大量的乙酸，其是最重要的挥发性酸，占黄酒总酸的20%以上。醇、酯、酸、醛等风味物质的相互融合，赋予了红谷黄酒丰满、醇香、协调的感官品质。

2.3 发酵过程中Alpha 多样性分析

如表3 所示，10 次取样中细菌和真菌不重复的OTU 总个数分别为438 和246。在97%相似度情况下，细菌ACE 指数为252.34～372.68，Shannon 指数为1.65～4.72，Chao 1 指数为234.03～395.22，覆盖率99.90%～99.94%。发酵5 d 和20 d 细菌Chao 1指数和ACE 指数数值较高，表明发酵5 d 和20 d 细菌群落丰富度较高，群落结构较为复杂。发酵4 d的Shannon 指数最高，随后逐渐降低，可能是发酵过程中低氧、高酸及高乙醇等因素导致许多细菌生长受抑制。

表3 发酵过程中细菌和真菌多样性指数表Table 3 Table of bacteria and fungi diversity indexes during fermentation

发酵过程中真菌ACE 指数为96.59～220.62，Shannon 指数为1.28～3.69，Chao 1 指数为89.50～176.00，覆盖率99.97%～99.99%。发酵30 d 的Shannon 指数最大，表明发酵结束时酒糟微生物多样性远高于发酵期。实验样品中细菌和真菌文库覆盖率都较高，表明本次测序结果基本能够代表样品实际情况。

2.4 发酵过程中菌落结构变化

2.4.1 细菌结构 在门水平10 次取样共检测出14 个细菌门，主要细菌门（平均含量大于1%）有变形杆菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）（图1a）。10 次取样中均有分布且相对丰度较高的为Proteobacteria 和Firmicutes。变形菌门是细菌中最大一门，包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等著名的种类[36]，生长可能会受到发酵过程中低氧、高酸及高乙醇等因素抑制。

图1 发酵过程中主要细菌门和主要细菌属分布Fig.1 Changes in relative abundance of major bacterial phylum and major bacterial genus during fermentation

在属水平10 次取样共检测出228 个细菌属，主要菌属（平均含量大于0.1%）有克雷伯氏菌属（Klebsiella）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳球菌属（Lactococcus）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、片球菌属（Pediococcus）、大肠埃氏菌属-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、布劳特氏菌属（Blautia）（图1b）。发酵过程中主要优势菌属为Klebsiella、Lactobacillus、Lactococcus和Pediococcus。随着发酵进行Lactobacillus相对丰度逐渐增加并在发酵末期成为绝对优势菌属，这与韩国米酒中发现乳杆菌属细菌在米酒发酵阶段逐渐成为优势菌结果一致[37]。乳杆菌属、片球菌属、乳球菌属都是乳酸菌，乳酸菌在酿造过程中能利用发酵糖类产生乳酸等降低酒中pH，并且乳酸与乙醇反应生成酯类是酒中重要风味物质，同时乳酸菌代谢产生乙酰和双乙酰赋予酒特色风味[38]。肠杆菌属一般为非条件致病菌或条件致病菌，部分肠杆菌属是为人体肠道内正常微生物，能够利用糖酵解和戊糖磷酸途径对糖进行降解产生有机酸[37]。芽孢杆菌的α-淀粉酶活性和糖化酶活性很高[37,39]，有利于黄酒主发酵的糖化，但红谷黄酒中未发现芽孢杆菌，这可能是酒曲原料及酿造工艺的不同，导至酒曲微生物组成也不同。

2.4.2 细菌属群落结构相似性 由NMDS 图（图2a）可知，发酵3、7 d 的细菌属群落同在第三象限；
发酵2、4、5、6、10、20、30 d 的细菌属群落较近，都靠近横轴差异较小；
发酵1 d 细菌属远离其他发酵时间的，差异较大为单独群组。如图2b，10 次取样细菌属群落可分为3 类，发酵3、7 d 的细菌属群落可聚为一类，发酵2、4、5、6、10、20、30 d 的细菌属群落聚为一类，发酵1 d 细菌属单独为一类。NMDS 图分析结果和Beta 分析较为相似。

图2 细菌属群落结构相似性分析Fig.2 Community structure similarity analysis of bacterial genera

2.4.3 真菌结构 在门水平上10 次取样共检测出7 个真菌门，主要（平均含量大于1%）为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）（图3a）。在整个发酵过程中Ascomycota 是绝对优势菌门，说明其在发酵过程中起主要作用。有研究表明子囊菌门不仅是黄酒发酵过程中优势真菌，也是白酒及食醋等多种发酵食品中主要真菌群落[40]。子囊菌中有些著名真菌（酿酒酵母等）是烘焙和酿造工业的基础菌株[41]。

在属水平上10 次取样共检测出108 个真菌属，主要的真菌属（平均含量大于0.1%）有红曲霉属（Monascus）、酵母属（Saccharomyces）、塞伯林德纳氏酵母属（Cyberlindnera）、Apiotrichum、米勒氏酵母属（Millerozyma）、Saitozyma、镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）、被孢霉属（Mortierella）、分子孢子菌属（Cladosporium）（图3b）。不同发酵时期真菌群落组成相似但丰度存在较大差异。Monascus、Saccharomyces在发酵过程中是优势真菌属。酵母菌属是一种重要真菌有较强发酵、高产乙醇能力，乙醇耐受性强，能发酵葡萄糖、麦芽糖等产生酒精，在酿酒工业中有着重要应用[42]，是白酒酿造过程中最主要的功能菌株[43]。

图3 发酵过程中主要真菌门和主要真菌属的分布Fig.3 Changes in relative abundance of major fungi phylum and major fungi genus during fermentation

2.4.4 真菌属群落结构相似性 由主成分分析（图4a）可知，发酵2、3、7 d 的真菌属群落距离较近，差异性较小；
发酵4、5、6、10 d 的真菌属群落距离较近，差异性较小；
发酵1、20、30 d 的真菌属群落均离其他菌落较远，差异较大为单独组群。由NMDS 图分析（图4b）可知，10 次取样真菌群落聚类分析后可分为5 个类群，发酵2、3、7 d 的真菌属聚为一类，发酵4、5、6、10 d 的真菌属聚为一类，发酵1、20、30 d 的真菌属分别单独为一类。Beta 分析结果与PCA 分析较为相似。

图4 真菌属群落结构相似性分析Fig.4 Community structure similarity analysis of fungi genera

2.5 发酵过程中微生物群落与代谢产物相关性

2.5.1 理化指标与微生物群落相关性分析 利用SPSS 软件对红谷黄酒发酵过程中理化指标与微生物多样性进行Pearson 相关性分析。如表4 所示，细菌多样性与还原糖呈显著负相关，相关系数为-0.664（P＜0.05）；
与总酸呈显著正相关，相关系数为0.644（P＜0.05）；
氨基态氮与真菌多样性呈显著正相关，相关系数为0.643（P＜0.05）。

表4 发酵过程中理化指标与微生物多样性的相关性Table 4 Correlation coefficients between physicochemical indicators and microbial diversity during fermentation

2.5.2 微生物群落与挥发性物质相关性 图5 显示微生物与挥发性化合物相关性。3 个细菌属与挥发性化合物显著相关（P＜0.05）。Klebsiella与辛酸乙酯显著负相关（P＜0.05）；
Lactobacillus与2,3-丁二醇、乳酸乙酯极显著正相关（P＜0.01）；
Lactococcus与乙醇、2-丁醇、异丁醇、苯乙醇和棕榈酸乙酯呈显著负相关（P＜0.05）。有研究表明Lactobacillus是酱香型白酒窖内发酵过程中最常见重要微生物菌群[44]。Lactobacillus在谷物当中普遍存在，能将葡萄糖转化为乳酸，为酵母形成乳酸乙酯提供底物，而乳酸乙酯是白酒中重要的风味成分之一[45]。Lactobacillus和Klebsiella与醋酸呈现较强的相关性[46]。

图5 红谷黄酒发酵过程中微生物群落与挥发性物质相关性热图Fig.5 Heatmap of correlation between microbial community and volatile substances during fermentation of red millet Huangjiu

9 个真菌属与挥发性化合物显著相关（P＜0.05）。Monascus与乳酸乙酯显著负相关（P＜0.05）；
Cyberlindnera与2,3-丁二醇和乳酸乙酯极显著正相关（P＜0.01）；
Apiotrichum与2-丁醇、异丁醇和异戊醇显著负相关（P＜0.05）；
Millerozyma与亚油酸乙酯和乙醛显著负相关（P＜0.05）；
Saitozyma、Fusarium、Alternaria、Mortierella和Cladosporiu与2,3-丁二醇以及乳酸乙酯显著正相关（P＜0.05）；
Fusarium与乙酸乙酯和辛酸乙酯显著正相关（P＜0.05）；
洪家丽等[18]研究发现米曲霉和紫色红曲霉等真菌与发酵过程中的大部分挥发性风味物质呈负相关，这与本研究类似。酵母菌属在发酵过程中对风味物质的影响较大，与乳酸乙酯和亚油酸乙酯呈正相关[47]，而本文结果中酵母菌属与乳酸乙酯负相关，与亚油酸乙酯呈正相关，但结果并不显著（P＞0.05）。链格孢属与酸类物质有较强的相关性，与风味的形成关系密切[48]，在空气中大量存在，能够在粮食中快速生长但不利于大曲发酵和白酒酿造[49]。链格孢属与异丁醇有极强的相关性[46]，在本研究中链格孢属与异丁醇呈正相关，但结果并不显著（P＞0.05）。

本研究利用高通量测序技术分析红谷黄酒不同发酵时期样品中微生物群落及其多样性。结果显示红谷黄酒不同发酵时期共检测出14 个细菌门和228 个细菌属；
7 个真菌门和108 个细菌属。不同时期菌落结构相似但丰度却有较大差异，体现了红谷黄酒发酵过程微生物组成种类的复杂程度。

对红谷黄酒发酵过程中理化指标及风味与微生物多样性进行Pearson 相关性分析显示，发酵过程中细菌属水平与总酸正相关，与还原糖负相关，真菌属水平与氨基态氮正相关。3 个细菌属、9 个真菌属与挥发性化合物显著相关（P＜0.05）。乳酸杆菌属在发酵过程中逐渐成为优势菌属，为酒中重要风味乳酸乙酯的形成提供底物。酵母菌属在发酵过程中对风味物质的影响较大，与多种酯类物质的形成有相关性。这些对酒风味物质的改善有重要的意义。

酒的品质、风味受微生物代谢产物影响很大，本研究通过对红谷黄酒发酵过程中微生物群落结构及与风味相关性进行分析，为后续红谷黄酒品质提升与发展提供理论参考。但是同时也有一些可能对人体健康构成潜在威胁的物质被检出，例如致病菌克雷伯氏菌属，这说明黄酒在酿造过程中尤其是主发酵阶段容易受原料、环境和病原微生物的影响，在今后酿造黄酒的过程中应如何避免这类物质的污染还有待研究，或许可以从原料的灭菌、通气的方式以及发酵环境等方面入手。