微小RNA在糖尿病肾病发病机制中的研究进展

段英连 马婵娟

1山西医科大学，太原 030000；
2山西省人民医院肾内科，太原 030053

Williams等[1]结合国际糖尿病联合会发布的第9版《糖尿病图集》的结果，对211个国家和地区的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病情况进行了重新评估，估计2019年大约有4.63亿人患有DM，预计这一数字将在2030年增加25%，在2045年增加51%。糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是一种进行性的肾脏疾病，可导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)，是DM患者预期寿命减少的主要原因。其特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蓄积，肾小球和肾小管基底膜增厚，肾小球系膜基质增加，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化，并伴有蛋白尿和肾功能下降[2]。

一般来讲，DKD患者的临床预后较差，原因之一为临床症状出现延迟，这种症状通常在肾脏损害实际开始后5～10年显现出来。因此，临床上DKD需要早发现、早干预，以减轻肾功能的丧失并改善预后。目前尿微量白蛋白已成为临床上DM早期肾脏损害的最广泛接受的实验室筛查指标，但早在2006年一项英国的2型糖尿病肾功能不全的危险因素的前瞻性研究表明，部分DM患者在出现肾功能不全之前，患者的尿蛋白或尿微量白蛋白可能表现为阴性[3]。所以，对于某些DKD患者而言，尿微量白蛋白既不是肾功能不全的准确标志，也不是DKD疾病进展的可靠预测因子。由于现有的实验室化验筛查指标暂不能在肾功能减退真正发生之前确定那些有发展为微血管并发症风险的患者，因此积极寻找DKD肾脏损害早期阶段的标记物可为预防肾脏功能丧失提供巨大的临床益处。微小RNA(microRNA,miRNA)很稳定，可以在人的体液中检测到，已作为肾脏生物标志物获得了优势，并为肾脏疾病包括DKD在内的诊断和监测中的提供补充[4]。现已明确DKD发病机制与细胞外基质积累、氧化应激、炎症反应、自噬等有关[5]，本文将对miRNA在这些机制中的调控作用进行综述。

DNA元素百科全书(the Encycldia of DNA elements，ENCODE)项目的开始，标志着非编码RNA(non-coding，ncRNA)的存在，提示它们构成了人类基因组的主要组成部分(约75%)，并且它们在基因表达中起主要作用。miRNA是多细胞动物中核苷酸长度为20～30的ncRNA之一，主要通过参与靶mRNA降解或阻遏其翻译而调控基因表达，对发育、造血、器官发生、细胞增殖等具有调控作用。miRNA稳定性较高，可以在人的体液中检测到，参与许多疾病发生发展的调控，特别是在DM和肾移植受者病程进展至慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的患者中，miRNA的表达与肾小管间质硬化和终末期肾小球病变发生相关，miRNA作为一种有潜力的生物标志物在未来临床发展中有广阔的前景[4]。

1.miRNA与细胞外基质积累 众所周知，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白在肾小球的系膜和基底膜以及肾小管间质中过度沉积是DKD的特征之一，它减少了滤过面积最终导致肾小球硬化[6]。过多的ECM积聚最终会导致肾小球硬化，这是进行性肾功能丧失的第一步，也是至关重要的一步。形态学检查显示，在体内和体外，上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)发生、ECM沉积和肾纤维化病变均表现为E-钙粘蛋白(E-cadherin，E-cad)表达降低，α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和胶原蛋白Ⅲ含量增加。

系膜细胞的肥大表型具有成纤维细胞的特征，具体表现为α-SMA、平滑肌22蛋白(smooth muscle 22，SM22)和ECM蛋白(如Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白和纤连蛋白)的表达升高。Wang等[7]通过基因芯片分析发现糖尿病db/db小鼠肾皮质中miR-214水平显著上调，进一步体外实验表明抑制miR-214上调可显著降低SM22、α-SMA和Ⅵ型胶原蛋白的表达，并且在人胚胎肾细胞中通过荧光素酶测定法将PTEN鉴定为miR-214的靶基因，随后实验证实部分恢复PTEN水平，可减弱白蛋白尿和肾小球系膜的扩张。这些体内和体外的研究表明miR-214和PTEN之间的串扰可减轻肾小球肥大。因此，miR-214可能是DKD的新型治疗靶点。Yu等[8]在DKD大鼠实验中观察到miR-370、纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和纤溶酶原激活物抑制-1(plasogen activator inhibitor 1，PAI-1)表达升高，但canopy 1(CNPY1)表达降低；
之后经生信软件及荧光素酶测定确定了CNPY1为miR-370的靶基因，并发现miR-370的过表达通过抑制CNPY1来促进肾小球系膜细胞增殖和ECM积累。上述研究列举了miRNA调控ECM蛋白合成过程中的靶基因，通过探索miRNA与靶基因之间的信号通路网络调控关系，对未来实现DKD的靶向治疗提供了思路。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad2/3信号传导途径是参与DKD肾脏纤维化形成的公认途径。TGF-β1与其受体结合后，通过两个关键的下游介质Smad2和Smad3发出信号，诱导肾小管上皮细胞发生EMT，从而促进ECM蛋白的产生及沉积，最终发展为广泛的肾组织纤维化，而此过程受到Smad7负反馈调节。Wang 等[9]在体内(链脲佐菌素诱导的DM大鼠模型)和体外(高葡萄糖条件下的大鼠肾小管上皮细胞模型)研究了SnoN蛋白与miR-21、TGF-β途径之间的关系。他们发现在这两个模型系统中，SnoN蛋白的表达量与miR-21成反比，SnoN蛋白对TGF-β途径起负调节作用，miR-21通过激活TGF-β1/Smads信号转导途径增强了ECM沉积和α-SMA表达而在DKD中发挥作用。既往研究已证明钙释放激活钙通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1，Orai1)通过TGF-β1/Smad3途径参与TGF-β1诱导的EMT。Ma等[10]观察到肾纤维化组织和TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)中miR-93显著降低，而且DKD中miR-93表达的降低导致Orai1表达增加，之后促进了TGF-β介导的ECM积聚和纤维化。Sun等[11]运用qRT-PCR测定miR-133b和miR-199b在OLETF大鼠、LETO大鼠和TGF-β1在HK-2细胞中的表达；
通过蛋白质印迹法和免疫组化检测胶原蛋白I、纤连蛋白、α-SMA、E-cad和sirtuin 1(SIRT1)的表达水平；
通过Masson染色以评估肾纤维化程度；
通过荧光素酶报告基因分析和RNA免疫沉淀分析探索了SIRT1与miR-133b、miR-199b之间的相互作用。最终结果表明，通过上调SIRT1抑制miR-133b和miR-199b的表达可减轻TGF-β1诱导的EMT和肾纤维化，这表明使用不同的miRNA是将来治疗DKD的潜在策略。

Kato等[12]观察到在DKD小鼠模型的肾小球中以及用TGF-β1或高葡萄糖治疗的肾小球膜细胞中，近40个miRNA的大型簇及其宿主长的非编码RNA转录物(long non-coding RNA transcript，lnc-MGC)协同增加。靶向lnc-MGC的化学修饰寡核苷酸可抑制DM小鼠的簇微RNA、肾小球ECM和肥大。因此，抑制lncMGC的表达可以作为DKD的潜在疗法，以降低内质网应激后miR-379簇上调诱导ECM积累和肥大的作用。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是TGF-β超家族中的关键成员之一。研究发现在肾纤维化期间，BMP的增加可抑制TGF-β1介导的肾小管上皮细胞中的EMT和ECM积累，从而发挥抗小管间质纤维化的作用[13]。Liu等[14]实验发现BMP-7的表达可以通过调节miR-21/Smad7来影响TGF-β1/Smad3信号通路，抑制EMT和ECM沉积，参与了DKD的抗纤维化过程。目前的研究中，有报道表明NEAT1在链脲佐菌素诱导的DKD大鼠模型和高糖诱导的小鼠系膜细胞中显著增加。研究者们发现，敲除NEAT1会抑制DKD大鼠的肾损伤，并且会下调NEAT1调节的ECM蛋白(ASK1、纤连蛋白和TGF-β1)和EMT蛋白(E-钙黏着蛋白和N-钙黏着蛋白)的表达。Wang等[15]发现，锌指E-box结合同源盒1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)为miR-27b-3p的靶标，揭示了NEAT1在DKD的纤维化和EMT中的潜在作用。他们的实验证明NEAT1可以通过调节miR-27b-3p和ZEB1来抑制DKD的进展，NEAT1可以作为DKD的有效生物标志物和治疗靶标。

2.miRNA与氧化应激 氧化应激是指机体在受到各种有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统之间平衡失调，导致组织细胞损伤。氧化应激已被证实为DKD组织损伤的关键机制之一[16]，许多介质参与了这一过程，但最重要的是高血糖症本身以及糖基化终产物的产生，这些终产物能触发活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的产生和线粒体功能障碍。同样，内在抗氧化反应的诱导通过核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2)转录途径的激活而发生。Li等[17]发现miR-25可减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞的氧化应激和凋亡。他们首先使用miRNA芯片测定了DKD患者肾脏组织及血清样品中miR-25的表达情况，发现miR-25下调，血清miR-25水平与蛋白尿成反比关系；
随后在高糖处理的人肾小管细胞中发现miR-25的过表达通过PTEN/AKT信号途径减少了ROS的产生，抑制了高糖诱导的细胞损伤模型中的细胞凋亡，减轻肾功能损伤。

众所周知，解偶联蛋白-2(uncoupling protein-2，UCP-2)直接参与调节线粒体膜电位，UCP-2的过表达可降低ATP的产生，防止DM大鼠肾脏中线粒体ROS过多形成[18]。Yang等[19]测定DKD大鼠外周血中miR-214的表达，用ELISA法测量氧化应激和ROS水平。实验结果表明，DKD大鼠的外周血中miR-214表达显著降低。随后的体外实验表明，在HK2细胞中miR-214的过度表达可调节UCP2表达及其下游途径，ROS/AKT/mTOR信号通路显著降低。他们的实验发现miR-214的高表达可调节ROS/Akt/mTOR信号通路从而抑制DKD中的氧化应激，发挥肾脏保护作用。

Nrf2作为一种转录因子，在细胞氧化应激中有重要的调控功能，可维持氧化还原稳态。内在抗氧化反应的诱导通过抑制Nrf2阻遏物Keap-1而激活Nrf2转录途径产生。激活此途径的化合物已经在临床试验中进行了测试，表明Nrf2转录的激活是DKD的潜在治疗靶点[20-21]。对糖尿病GK大鼠和Wistar大鼠进行定量miRNA转录组分析阵列，免疫组织化学和蛋白质印迹研究发现miR-200a表达增加后可激活Nrf2转录途径激活抗氧化防御酶，进而减轻DM所致肾组织损伤[22]。

NADPH氧化酶衍生的超氧化物是高血糖诱导的DKD氧化应激的关键。NOX4是肾脏组织中NADPH氧化酶的主要亚基，在微血管内皮、肾小球系膜细胞和足细胞中显著表达[23-24]。Fu等[25]实验中发现糖尿病大鼠肾脏和高糖处理的系膜细胞中的miR-25水平均显著降低，并伴随着NOX4表达水平的增高。随后通过荧光素酶报告基因检测法直接靶向NOX4的3"-UTR，表明miR-25对NOX4表达负调控，最终结果揭示miR-25作为内源性基因沉默因子调节DKD中NOX4基因的表达，影响DKD氧化应激。此外，NOX4基因的表达也受到miR-423-5p的调控。Xu等[26]在DKD患者肾脏组织中miR-423-5p下调，但在体外培养的足细胞中HG诱导NOX4抑制了miR-423-5p表达。这项研究表明，miR-423-5p过表达可通过靶向NOX4抑制ROS的生成来保护HG诱导的足细胞损伤，从而提供了针对DKD的潜在治疗策略。Oh等[27]在之后的实验中发现，miR-25的表达还受到与Homeodomain相互作用的蛋白激酶2(homeodomain-interacting protein kinase 2，HIPK2)的调控，表明在维持ROS方面，HIPK2-miR-25-NOX4的调控复杂。这些研究进一步重申了NOX4对DKD氧化应激复杂而严格的调控。

3.miRNA与炎症反应 DKD的发病与全身和肾脏局部炎症反应有关。一些炎性细胞因子如白介素(interleukin，IL)、肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)、巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)、免疫介质和黏附分子水平会随着疾病的进展而增加[28]。

Petrica等[29]探究了2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)合并DKD患者的血清和尿液中ILs(IL-α、IL-8、IL-18)与不同miRNAs(miRNA-21、124、125a、126、146a、192)的相关性。值得注意的是这项研究发现IL-α与miRNA-125a、126、146a和192负相关，这些miRNAs都具有肾脏保护作用。Rovira-Llopis等[30]测定了T2DM合并DKD患者血清TNFα、IL-6和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的水平，评估了miR-31与这些细胞因子的表达关系，发现miR-31与TNFα和IL-6与ICAM-1之间呈负相关关系。这表明随着miR-31水平的降低而炎症反应加剧，并且发现miR-31调控DKD与炎性因子和黏附分子促进白细胞募集到血管壁有关，他们推测miR-31可作为DKD敏感的预后生物标志物。Huang等[31]在DKD患者、1型糖尿病大鼠和2型糖尿病大鼠模型实验中得出了一致的结论，miR-155和miR-146a的表达增加可加重炎症介导的肾小球内皮损伤。Zhao等[32]发现db/db小鼠肾脏组织中的miRNA-337表达上调可增加IL-6和IL-18的水平而导致足细胞损伤。

在炎症方面，miR-27a是一种促炎性miRNA，可负调节NRF2和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)的表达，从而促进促炎性细胞因子的分泌。Hou等[33]在DKD动物和细胞模型中，发现miR-27a通过抑制PPARγ激活TGF-β/Smad3信号传导，并促进结缔组织生长因子，纤连蛋白和胶原I等纤维化的关键介质的表达变化。值得注意的是，此项研究发现miR-27a与血肌酐、蛋白尿、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的升高及肾小球滤过率的降低有关，具有临床和生物学意义。因此，监测血浆miR-27a水平及其与PPARγ的关系可用于反映肾脏纤维化的严重程度，靶向miR-27a可作为DKD的潜在治疗方法。单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是一种趋化因子，可将巨噬细胞募集到炎症部位，对DKD的发生和发展很重要。Yang等[34]发现在DKD组织中miR-374a被下调而MCP-1被上调。随后在HK2细胞中证实了MCP-1是miR-374a的靶标，并发现转染miR-374a模拟物可下调IL-6、IL-18以及TNF的水平，并且在DKD患者肾小管上皮细胞中发现miR-374a表达的恢复阻止了炎症反应。这些实验表明，靶向miR-374a/MCP-1轴的治疗策略可能是DKD的有效治疗方法。另一个抗炎miRNA是miR-455-3p。Wu等[35]在HG或TGF-β1刺激的人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells，HGMCs)和HK-2细胞中发现miR-455-3p被下调，并将Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho associated coiled coil containing procrastinate 2，ROCK2)确定为miR-455-3p的直接目标，miR-455-3p负调控ROCK2的表达，并因此减少了HGMCs中的炎性细胞因子和纤维化标记物。该实验证明miR-455-3p通过抑制ROCK2表达在肾纤维化的治疗中起着至关重要的作用，miR-455-3p可能作为DKD的治疗靶点。

Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)能识别各种微生物成分并诱导免疫反应，并且与DM的病理生理学有关。Ji等[36]用qRT-PCR法检测了Gm6135和TLR4在DKD小鼠肾脏和高糖培养的小鼠系膜细胞中的相对表达水平。他们观察到Gm6135/TLR4的过表达或下调会显著影响小鼠系膜细胞的增殖和凋亡；
最终得出了Gm6135通过竞争性结合miR-203-3p来上调TLR4，从而进一步激活DKD小鼠促炎性细胞因子的分泌。有趣的是，Yao等[37]发现TLR4基因表达也受到miR-874的负调控。研究表明，链脲佐菌素诱导的DKD大鼠模型和葡萄糖诱导的小鼠足细胞模型miR-874的过表达通过靶向TLR4抑制了葡萄糖触发的足细胞损伤，并暗示miR-874/TLR4轴可能代表了DKD的病理机制。更深入地了解miRNA与DKD发病中炎症反应的关系，有助于找到新方法去预防、治疗或延缓DKD的进展。

4.miRNA与自噬 自噬作为许多生物学功能的重要途径已引起广泛关注。它在正常和疾病状态(包括免疫力、炎症、发育和衰老、代谢和神经退行性疾病以及癌症)中起关键作用[38]。自噬是一种溶酶体蛋白降解途径，可将细胞内成分传递至溶酶体进行降解以维持体内平衡和细胞完整性。自噬诱导是由雷帕霉素靶蛋白复合物1(Mammalian target of ropamycin complex 1，mTORC1)控制的，它可以感应和整合来自多种来源的应激信号，包括生长因子、氨基酸、低氧血症和能量水平。在营养充足的条件下，mTORC1通过阻止Ulk1/2复合物的组装而抑制自噬。自噬途径并不孤立存在，而是与miRNA交叉调节的其他细胞信号网络整合在一起。现已确定miRNA在自噬的各个阶段(包括诱导、囊泡成核、延伸和完成、对接和融合以及降解和再循环)具有关键作用。

近年来，人们越来越关注自噬在肾脏疾病中的作用，并发现自噬的缺乏会导致包括DKD在内的肾脏疾病的发病[39]。自噬诱导的起始步骤之一是Ulk1复合物的激活，它由AMPK-mTORC1通路直接调控。据报道，有几种miRNA调节AMPK-mTORC1通路干扰上游自噬信号。Lu等[40]观察到，高糖培养的系膜细胞中miRNA-21表达上调可上调靶基因PTEN的表达，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，并增强自噬作用，以减少ECM蓄积并改善系膜细胞肥大和增殖。Matboli等[41]的实验表明，高脂饮食或链脲佐菌素诱导的DM大鼠中调节某些miRNAs的水平触发AMPK-PIK3途径诱导自噬发生，可以减轻肾组织损伤。

Wang等[42]研究首次揭示了一个新的信号环路p53/miR-155-5p/Sirt1的存在，证明人肾近端肾小管细胞中miR-155-5p的过表达会抑制sirt1调节的自噬通路，并作为DKD的治疗靶点。Xu等[43]发现miR-18a-5p在足细胞中的过表达导致对Caspase 3裂解蛋白的显著抑制，并增加了LC3-II/LC3-I的比例；
随后通过双重萤光素酶报告检测进一步确定了共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM)是miR-18a-5p调控的靶基因。这项研究表明，miRNA-18a-5p可以通过靶向ATM基因来增强自噬作用，这可能是预防和减轻DKD的有希望的治疗靶标。

在各种肾脏疾病中识别和鉴定miRNA可能使得新型诊断工具和治疗干预手段的开发取得突破。尽管如此，还需要进一步研究，以确定自噬在更具体的疾病环境中是起保护作用还是加速病变发展。这些研究成果说明miRNA对自噬的调控可以影响DKD发展过程中的生物学功能，miRNA有望充当自噬途径的新型有效调节剂，也为DKD的预防及治疗提供了新思路[44]。

DKD无论肾脏受累程度如何，它都会降低患者的生活质量并增加早期死亡的风险。目前DKD的治疗效果差，往往进展到一定阶段不可逆，所以尽早的诊断和及时的干预对DKD患者来说刻不容缓。目前侵入性肾脏组织穿刺活检是诊断DKD的金标准，但价格较贵且有创，在患者无明显症状的疾病早期阶段不会选择此种检查手段，因此无法在疾病早期进行。miRNA生物标志物具有无创性和成本优势，可作为有效的手段，可以在严重肾损害发生之前就发现肾脏代谢的变化。最近几年，miRNA在肾脏的发育、生理及病理调控中已成为一个重要且富有成果的研究领域。然而，miRNA在肾脏疾病发展中的研究仍处于早期阶段，但进展迅速。本文从miRNA在细胞外基质积累、氧化应激、免疫炎症因素、自噬机制中的调控作用进行阐释。相信未来更深入地对相关研究探索发现，可能会开发出普及的、固定的DKD相关miRNA数据库，方便临床工作者对DKD的早期诊断、预后预测、严重性评估和治疗效果评价。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突