膜联蛋白A7及血管内皮生长因子在乳腺癌组织中的表达及临床意义

佟力军，王洪海

(1.内蒙古民族大学第二临床学院(内蒙古林业总医院) 病理科，内蒙古 呼伦贝尔 022150；
2.大连医科大学 基础医学院 病理学与法医学教研室，辽宁 大连 116044)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率位于女性恶性肿瘤的首位[1]。近年来其发病率呈现逐年升高趋势，发病年龄趋于年轻化。目前，随着我国居民健康意识的转变及乳腺癌诊断、治疗技术的提高，乳腺癌死亡率逐年下降。但值得注意的是，有部分乳腺癌患者治疗后预后仍较差。研究表明，乳腺癌是一种异质性的恶性肿瘤，不同患者临床预后存在一定差别[2]。随着精准医学时代的到来，分析乳腺癌组织中不同分子表达情况及对患者预后的影响对于指导治疗具有重要的意义。膜联蛋白A7(annexin A7,ANXA7)是膜联蛋白超家族的重要成员之一，有研究报道，ANXA7与胃癌、直肠癌、肝癌等发生有密切关系[3-5]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一类分布广泛的细胞生长因子，具有促进血管和淋巴管生成的作用，与肿瘤发生、发展和侵袭转移密切相关[6]。但目前对于乳腺癌组织中ANXA7、VEGF的表达情况及两者关系尚无定论。本研究探讨ANXA7及VEGF在乳腺癌组织中的表达及其临床意义，旨在为乳腺癌的临床诊治提供依据。

1.1 一般资料

选择2015年1月至2017年3月内蒙古林业总医院收治的乳腺癌患者94例，纳入标准：(1)所有患者均为初发、单侧乳腺癌患者，并经病理诊断为浸润性导管癌；
(2)接受手术治疗，术后完成3年随访；
(3)病历资料完整，患者及家属对研究知情同意。排除标准：(1)失访患者；
(2)三阴性乳腺癌患者；
(3)合并其他系统肿瘤患者。患者年龄35～78岁，平均年龄(50.26±5.63)岁；
肿瘤直径：≤2 cm 37例、>2 cm 57例；
病理分级：Ⅰ级32例、Ⅱ级39例、Ⅲ级23例；
TNM分期：Ⅰ期33例、Ⅱ期30例、Ⅲ期31例；
有淋巴道转移28例，无淋巴道转移66例。标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，并经两位高年资病理医师复诊。本研究经过医院伦理学审查同意。

1.2 方 法

所有患者手术中切取乳腺癌组织及距离肿瘤边缘3 cm的癌旁组织，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成4 μm连续切片。应用Roche Ventana Benchmark XT全自动免疫组化仪进行检测，试剂为兔抗人ANXA7单克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体、兔抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)单克隆抗体、兔抗人雌激素受体(estrogenreceptor,ER)单克隆抗体、兔抗人孕激素受体(progesteronereceptor,PR)单克隆抗体、免疫组化染色试剂盒、DAB显色液，均为Roche公司生产的配套试剂。程序如下：76 ℃脱蜡4 min，缓冲液冲洗，37 ℃过氧化氢甲醇消化内源性过氧化物酶4 min，缓冲液冲洗，pH值8.0～8.5的抗原修复缓冲液100 ℃抗原修复15 min，缓冲液冲洗，加入山羊血清封闭，加入生物学一抗37 ℃下12 min，生物学二抗37 ℃下8 min，缓冲液冲洗，DAB显色，苏木素复染、返蓝、取出完成的玻片，常规酒精脱水、透明、中性树胶封片后在显微镜下观察，用PBS代替生物学一抗作阴性对照，用说明书配套阳性样本作为阳性对照。

1.3 结果判定

根据显色程度及阳性细胞所占比例进行评分[7]：标本无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；
阳性细胞≤10%为1分；
11%～50%为2分；
51%～75%为3分；
>75%为4分。再将两项积分乘积得总积分：总积分 0～3分为(-)；
总积分4～5分为(+)；
总积分6～7分为(++)，总积分8分以上为(+++)。(+)～(+++)判定为阳性。

1.4 随 访

所有患者随访3年，随访时间至2020年3月结束。观察患者复发及远处转移发生率，根据情况分为复发组、未复发组；
远处转移组、无远处转移组。

1.5 临床病理参数分析

分析不同年龄、肿瘤大小、病理分级、TNM分期、淋巴结转移、HER-2、ER、PR表达情况、复发、远处转移情况患者乳腺癌组织中ANXA7、VEGF阳性表达情况。

1.6 统计学方法

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织中ANXA7、VEGF蛋白表达情况

乳腺癌组织ANXA7、VEGF阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)，见表1，图1。

表1 乳腺癌组织及癌旁组织中ANXA7及VEGF的表达 [n(%)]

A:乳腺癌组织中ANXA7表达(+++)；
B:乳腺癌旁组织中ANXA7表达(-)；
C:乳腺癌组织中VEGF表达(+++)；
D:乳腺癌旁组织中VEGF表达(-)图1 免疫组织化学法检测ANXA7、VEGF在乳腺癌组织中的表达(×400)Fig.1 Expression of ANXA7,VEGF in breast cancer tissues was detected by immunohistochemistry (×400)

2.2 ANXA7、VEGF蛋白在乳腺癌组织中表达与临床病理参数的关系

乳腺癌组织中不同年龄、肿瘤大小、ER、PR表达情况ANXA7、VEGF阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。随病理分级升高乳腺癌组织中ANXA7阳性率升高，VEGF阳性率升高，TNM Ⅲ期、HER-2阳性、淋巴结转移乳腺癌组织ANXA7、VEGF阳性率显著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、HER-2阴性、无淋巴结转移乳腺癌组织(P<0.05)。见表2。

所有患者完成3年随访，复发15例，复发率15.96%，远处转移9例，远处转移率9.57%。复发组ANXA7阳性率显著高于未复发组，远处转移组ANXA7阳性率显著高于未转移组(P<0.05)；
复发组VEGF阳性率与未复发组比较，差异无统计学意义，远处转移组VEGF阳性率与无远处转移组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 ANXA7、VEGF蛋白在乳腺癌组织中表达与临床病理参数的关系[n(%)]

2.3 乳腺癌组织中ANXA7蛋白与VEGF蛋白表达的相关性

ANXA7蛋白阳性乳腺癌组织中VEGF蛋白阳性率显著高于ANXA7蛋白阴性乳腺癌组织(P<0.05)，见表3。Spearman相关分析显示，乳腺癌组织中ANXA7蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关(rs=0.211，P=0.041)。

ANXA7又称为会连蛋白，最初是从牛肾上腺髓质中分离出来，是细胞内含量最为丰富的蛋白质之一[8]。人类ANXA7基因位于染色体10q21，其编码蛋白质具有Ca2+依赖的膜融合活性，可以促进膜融合、黏附、聚集、运输等[9-10]。研究表明，ANXA7还可以激活GTP酶，通过介导Ca2+/GTP信号通路，影响细胞的增殖与分化[11]。已有研究报道，在多种恶性肿瘤组织中存在ANXA7表达增高[12-13]。田焕娜等[14]报道，下调ANXA7可以促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，并认为ANXA7 可以促进乳腺癌发生。Wang XY等[15]报道ANXA7可以调节肿瘤淋巴管生成，促进淋巴道转移。众所周知，恶性肿瘤的生长与血管生成有密切关系，肿瘤细胞的增殖迅速，需要丰富的血管为其分裂、增殖、浸润和转移提供物质基础。VEGF是目前已知的最重要的促进血管形成的细胞因子，具有促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成的作用[16]。

表3 不同VEGF表达情况乳腺癌组织中ANXA7表达情况 [n(%)]

我们通过对94例乳腺癌及其癌旁组织中ANXA7蛋白及VEGF蛋白表达情况的检测分析发现，乳腺癌组织中ANXA7、VEGF蛋白阳性率显著高于癌旁组织，该结果与田焕娜的研究结果相符，表明ANXA7高表达与乳腺癌的发生有密切关系，分析ANXA7高表达可能通过抑制乳腺细胞凋亡、促进乳腺细胞恶性增殖，进而导致乳腺癌的发生。而VEGF蛋白高表达则与乳腺细胞恶性增殖、肿瘤周围血管及淋巴管生成增加有关[17]。进一步分析发现，随TNM分期升高，乳腺癌组织中ANXA7、VEGF蛋白阳性率升高，病理分级Ⅲ级、HER-2阳性、淋巴结转移的乳腺癌组织ANXA7、VEGF蛋白阳性率显著高于病理分级Ⅰ～Ⅱ级、HER-2阴性、无淋巴结转移的乳腺癌组织，推测ANXA7、VEGF可能与乳腺癌患者病理分级、TNM分期、淋巴结转移有密切关系。HER-2是一类原癌基因，其表达蛋白是一种跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性[18]。研究表明，HER-2参与肿瘤的增殖、分化和凋亡，其表达情况与乳腺癌的预后密切相关，已成为指导乳腺癌治疗及判断预后的重要指标[19]。本研究结果显示HER-2阳性乳腺癌组织ANXA7、VEGF蛋白阳性率显著高于HER-2阴性乳腺癌组织，同时乳腺癌组织中ANXA7蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关。推测HER-2可能与ANXA7、VEGF具有某种信号关联，发挥协同作用，共同促进乳腺癌的发生和发展，其具体机制有待于进一步研究证实。淋巴转移是乳腺癌转移的重要方式。既往有报道显示VEGF可以调节肿瘤淋巴管生成，促进乳腺癌淋巴道转移[20]。而Wang J等[21]报道，ANXA7可以促进诸如肝细胞癌等上皮细胞肿瘤淋巴道转移。我们结果也表明ANXA7、VEGF与乳腺癌淋巴结转移有密切关系，为肿瘤淋巴结转移的机制研究提供了依据。

本研究对患者进行了3年随访，并对患者预后进行了比较，结果显示，复发组ANXA7阳性率显著高于未复发组，远处转移组ANXA7阳性率显著高于未转移组。分析其原因可能与ANXA7可以促进肿瘤淋巴管生成，从而促进淋巴转移有关。而复发组VEGF阳性率与未复发组比较差异无统计学意义，远处转移组VEGF阳性率与无远处转移组比较差异无统计学意义，则表明VEGF与乳腺患者近期预后无关，也可能与本研究中VEGF阴性组病例数较少有关。提示ANXA7可以对乳腺癌患者的预后判断提供依据，也可对乳腺癌药物治疗提供研究方向。同时本研究也存在一定不足，我们的研究仅侧重于ANXA7、VEGF与患者临床病理特征及预后的分析，未涉及分子机制的研究，仍有待于今后进一步研究分析乳腺癌的分子生物学特征。

综上所述，乳腺癌组织中存在ANXA7、VEGF蛋白表达增高，两者在乳腺癌中表达呈正相关，ANXA7蛋白对乳腺癌的病理分级、TNM分期、肿瘤转移及患者的复发及预后判断具有一定价值，VEGF对乳腺癌的病理分级、TNM分期、肿瘤转移的辅助判断具有一定价值。